Pirmalaikis gimdymas dažniausia perinatalinio mirtingumo ir sergamumo priežastis išsivysčiusiuose kraštuose, iš jų ir Lietuvoje. Nors antenatalinė priežiūra yra padariusi didelę pažangą, pirmalaikių gimdymų per pastarąjį dešimtmetį nesumažėjo net ir labai išsivysčiusiose šalyse. Lietuvoje pirmalaikių gimdymų skaičius taip pat išlieka pastovus – apie 5-6 proc. visų gimdymų. Lietuvoje kasmet gimsta apie 1800 neišnešiotų naujagimių. Neišnešiotų naujagimių mirtingumas yra 30 kartų didesnis nei išnešiotų [1]. Motinos ir vaiko sveikatos rodmenys – nėščiųjų ir gimdyvių, perinatalinis, naujagimių ir kūdikių mirtingumas ir sergamumas -valstybės ekonominės ir socialinės brandos atspindys.

1998-2010 m. Lietuvos sveikatos programoje buvo iškeltas strateginis tikslas: iki 2010 m. kūdikių mirtingumą sumažinti 30 proc. 1998 m. Lietuvoje kūdikių mirtingumas buvo 9,2 iš 1000 gyvų gimusiųjų, 2009 m. jis sumažėjo iki 5,0 [1]. Taigi, per dešimtmetį kūdikių mirtingumas sumažėjo net 46 proc. Kūdikių mirtingumo mažėjimą lėmė naujagimių mirtingumo mažėjimas.

Modernios technologijos, nauji vaistai, aukšta gydytojų ir slaugytojų kvalifikacija lėmė, kad per pastaruosius metus labai pagerėjo neišnešiotų naujagimių išgyvenamumas. Tačiau, kai neišnešiotų naujagimių išgyvena vis daugiau, daugėja ir vaikų, kuriems augant išryškėja ilgalaikiai sutrikimai, pabloginantys tiek jų pačių, tiek visos šeimos gyvenimo kokybę. Žmogaus gyvenimo kokybės gerinimas – vienas iš šiuolaikinės medicinos uždavinių.

Išgyvenusiems neišnešiotiems vaikams dažniausiai pasitaikančios komplikacijos yra cerebrinis paralyžius (10 kartų dažnesnis nei išnešiotiems), psichikos sutrikimai (7,5 karto dažnesni), apsigimimai (7 kartų dažnesni), regos ir klausos pažeidimas (30 proc. neišnešiotų vaikų), judėjimo sutrikimai (25 proc. neišnešiotų vaikų), lėtinė plaučių liga [2, 3]. Net 25-50 proc. neišnešiotų vaikų, kurių gimimo svoris yra < 1500 g, reikalingas specialus papildomas lavinimas [4]. Tad ankstyvas neišnešioto naujagimio sveikatos vertinimas ir gyvenimo kokybės prognozė yra labai svarbūs, kad būtų galima kuo anksčiau pradėti tikslinį gydymą ir ankstyvą vaiko raidos korekciją. Pirmalaikio gimdymo prevencija - didžiausia antenatalinės pagalbos užduotis visame pasaulyje. Nurodoma, kad dažniausia neišnešioto naujagimio gimimo priežastis yra intrauterinė infekcija [5, 6]. Moteriai intrauterinė infekcija neretai yra lėtinė ir besimptomė, todėl pirmalaikį gimdymą gana sunku prognozuoti. Tyrimai rodo, kad dažniausiai kylančioji lytinių takų infekcija, ypač iki 32 nėštumo savaitės, sukelia subklinikinį chorioamnionitą, pirmalaikį vaisiaus vandenų nutekėjimą ir pirmalaikį gimdymą [7]. Naujausi tyrimai rodo pirmalaikio gimdymo, intrauterinės infekcijos ir uždegiminio proceso sąsajas. Intrauterinė infekcija gali sukelti vaisiaus infekciją ir uždegimą, inicijuoti vaisiaus uždegiminį atsaką, kuris apibrėžiamas vaisiaus uždegiminio atsako sindromu - VUAS. VUAS pasekmė - sunkūs vaisiaus ir naujagimio pažeidimai bei vėlesni liekamieji kūdikio sveikatos sutrikimai, tokie kaip cerebrinis paralyžius ir lėtinė plaučių liga [8, 9]. VUAS progresuodamas gali sukelti sepsinį šoką ir mirtį [10-12]. VUAS apibrėžiamas IL-6 koncentracijos padidėjimu vaisiaus kraujo plazmoje > 11 pg/ml [13]. Histologinė VUAS išraiška – virkštelės kraujagyslių uždegimas, arba funizitas [14], tačiau VUAS paprastai diagnozuojamas remiantis padidėjusia vaisiaus kraujo plazmos IL-6 koncentracija.

Mikroorganizmai ir jų išskiriamos medžiagos skatina vaisiaus mononuklearus gaminti citokinus: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a, laktoferiną, fibronektiną, defensinus, augimo veiksnius ir kt., kurie esant gimdos uždegimui dideliais kiekiais aptinkami motinos kraujyje, makšties ir gimdos kaklelio išskyrose, vaisiaus vandenyse, vaisiaus kraujyje [15-19]. VUAS diagnozuojamas iš vaisiaus kraujo mėginių, paimtų kordocentezės metu, tačiau daugiau tyrimų atlikta nustatant citokinų koncentracijas virkštelės kraujo plazmoje gimimo momentu [20-22]. Literatūroje nurodoma didesnė imunologinių tyrimų vertė, nes, esant bakterijų invazijai, citokinų koncentracijos padidėjimas nustatomas 6-10 kartų dažniau, nei aptinkamos pačios bakterijos [10].

Svarbu kuo anksčiau įvertinti naujagimio uždegiminio pažeidimo galimybę dėl grėsmingų VUAS komplikacijų. Vienų autorių nuomone, IL-6 virkštelės kraujyje turi būti tiriamas visais pirmalaikio gimdymo atvejais, kitų – visais atvejais, esant pirmalaikiam vaisiaus vandenų nutekėjimui. Tačiau kol kas šie tyrimai kasdienėje klinikinėje praktikoje neatliekami.

Literatūroje dažniausiai nurodomos IL-6 kritinės vertės CNS pažeidimo prognozei [21, 23, 24], tačiau TNF-a tikslių vertinimų virkštelės kraujyje stokojama [25]. VEGF atlieką pagrindinį vaidmenį vystantis kraujagyslėms. Šis veiksnys didina hematoencefalinio barjero pralaidumą ir yra susijęs su neišnešiotų naujagimių intraskilvelinėmis kraujosruvomis (ISK) [26]. Manoma, kad uždegiminio atsako metu padidėja VEGF gamyba ir išskyrimas [27]. Įrodyta šio veiksnio įtaka naujagimių bronchų ir plaučių displazijai atsirasti [28-31]. Vėliau VEGF pradėtas sieti su neišnešiotų naujagimių retinopatijos (NNR) išsivystymu [32-34]. Kai kurių autorių nuomone, VEGF ištyrimas 4-6-ą postnatalinio amžiaus savaitę neišnešiotų naujagimių kraujo serume galėtų būti vertingas diagnozuojant NNR. Tačiau tokių tyrimų mokslinėje literatūroje paskelbta tik keletas [35, 36]. Literatūroje neaptikome duomenų, rodančių virkštelės kraujo VEGF koncentracijos ir NNR ryšį.
Mokslinėje literatūroje pateikiamos įvairių formų (aktyvių TNF-a, VEGF arba bendrų TNF-a, VEGF ir baltymų junginių) TNF-a, VEGF koncentracijos kraujo plazmoje, todėl gauti rezultatai interpretuojami skirtingai.

2005 metais pirmą kartą Lietuvoje citokinų koncentracijas nėščiųjų makšties ir gimdos kaklelio išskyrose pradėjo tirti D. Bartkevičienė [17,37]. Nustatyta, kad šis tyrimo metodas yra tikslus prognozuojant pirmalaikį gimdymą ir įgimtą naujagimių infekciją bakterine vaginoze sergančioms nėščiosioms. M. Šilkūnas ištyrė gimdos ir vaisiaus kraujotaką toms nėščiosioms, kurių makšties ir gimdos kaklelio išskyrose rastos padidėjusios IL-ip ir IL-1ra koncentracijos. Šio tyrimo metu nustatyta, kad gimdos ir vaisiaus kraujotakos tyrimas dopleriu šiais atvejais padeda prognozuoti įgimtą naujagimių infekciją [38, 39].

Vaisiaus uždegiminio atsako sindromas negvildenta problema Lietuvoje. Virkštelės kraujo citokinų tyrimai iki šiol nebuvo atliekami. Mūsų bandymai taikyti šiuos tyrimus klinikinėje praktikoje yra pirmieji. Tikimės, kad tyrimo rezultatai padės tiksliau paaiškinti pirmalaikio gimdymo priežastis, geriau suprasti neišnešioto naujagimio sveikatos sutrikimus, padės prognozuoti vaiko raidą augant.

3. TYRIMO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas įvertinti VUAS įtaką neišnešioto naujagimio sveikatai ankstyvuoju ir vėlyvuoju adaptacijos laikotarpiais bei psichomotorinei raidai 6 ir 12 mėnesių koreguotame amžiuje.

Mokslinio darbo uždaviniai
1. Nustatyti ir įvertinti nėščiosios rizikos veiksnius prognozuojant VUAS.
2. Nustatyti ir įvertinti VUAS (kai virkštelės kraujo IL-6 > 11 pg/ml) įtaką neišnešioto naujagimio sveikatai po gimimo bei psichomotorinei raidai 6 ir 12 mėnesių koreguotame amžiuje.
3. Nustatyti ir įvertinti virkštelės kraujo citokinų IL-6, bTNF-a ir aTNF-a, bVEGF ir aVEGF ir neišnešioto naujagimio sveikatos ankstyvuoju ir vėlyvuoju adaptacijos laikotarpiais bei psichomotorinės raidos 6 ir 12 mėnesių koreguotame amžiuje tarpusavio ryšį.
4. Nustatyti virkštelės kraujo citokinų IL-6, bTNF-a ir aTNF-a, bVEGF ir aVEGF kritines vertes, prognozuojant neišnešioto naujagimio sveikatos sutrikimus ankstyvuoju bei vėlyvuoju adaptacijos laikotarpiais ir psichomotorinę raidą 6 ir 12 mėnesių koreguotame amžiuje.

4. SVARBIAUSI GINAMIEJI DARBO TEIGINIAI
1. Uždegiminių citokinų pokyčiai virkštelės kraujyje atspindi intrauterinės infekcijos ir imuninių procesų poveikį neišnešiotam naujagimiui.
2. VUAS daro įtaką neišnešioto naujagimio sveikatai po gimimo ir psichomotorinei raidai 6 ir 1 2 mėnesių koreguotame amžiuje.
3. Citokinų koncentracijų nustatymas virkštelės kraujyje yra tinkamas ir informatyvus tyrimo metodas prognozuoti neišnešioto naujagimio sveikatą po gimimo bei psichomotorinę raidą 6 ir 1 2 mėnesių koreguotame amžiuje.

5. DARBO NAUJUMAS IR MOKSLINE REIKŠME
Neišnešioto naujagimio gimimas ir ilgalaikiai jo sveikatos sutrikimai bei sunkūs liekamieji reiškiniai – viena aktualiausių akušerijos ir neonatologijos problemų. Citokinų tyrimai pirmalaikio gimdymo, neišnešioto naujagimio sergamumo priežastims išaiškinti yra pastarojo dešimtmečio mokslinių tyrimų dėmesio centre. Uždegimo žymenys, nustatyti nėščiųjų kraujo serume, makšties ir gimdos kaklelio išskyrose, vaisiaus vandenyse, vaisiaus kraujyje, suteikė galimybę klinicistams prognozuoti pirmalaikį gimdymą, komplikacijas po gimdymo, vaisiaus ir naujagimio pažeidimą.
Neonatologo uždavinys – naujagimio perinatalinio uždegiminio pažeidimo nustatymas ir su VUAS susijusių komplikacijų – CNS pažeidimo, lėtinių plaučių pakitimų ar naujagimio mirties rizikos laipsnio įvertinimas. Tam pagelbėtų virkštelės kraujo citokinų tyrimai. Tai gana nesudėtingas ir paprastas metodas, kuris Lietuvoje naujagimio sveikatos prognozės tikslu dar nebuvo taikytas. Šis darbas – tai pirmasis klinikinis bandymas, siekiantis įvertinti virkštelės kraujo uždegiminių citokinų pokyčių reikšmę neišnešioto naujagimio sveikatai po gimimo ir psichomotorinei raidai.

6. LITERATŪROS APŽVALGA

Mokslinės literatūros vaisiaus uždegiminio atsako klausimu ieškojome PubMed duomenų bazėje, naudojant šiuos MeSH terminus: longitudinal studies, comperative studies ir tekstinius žodžius: preterm delivery, intrauterine infection, cytokines, fetal inflammatory response, periventricular leukomalacia, IL-6, TNF-a, VEGF. Buvo atrinkti straipsniai anglų kalba, paskelbti spaudoje 2001¬2011 metais. Taip pat išnagrinėjome anksčiau nei per pastaruosius dešimt metų paskelbtus Lietuvos ir užsienio mokslininkų straipsnius bei straipsnių apžvalgas mus dominančios problemos klausimais.

6.1 Uždegiminis atsakas ir citokinai

Uždegiminis atsakas ir jo reikšmė. Uždegimu vadinama pirminė audinių reakcija į insultą [40]. Mokslui žengiant į priekį, uždegimas pradėtas interpretuoti kaip citokinų, chemokinų ir kitų uždegimo žymenų vietinis poveikis kraujagyslėms ir audiniams [41]. Vis dėlto sąvoka „histologinis uždegimas” mokslinėje literatūroje dar tebesiejama su tam tikrų ląstelių – neutrofilų, makrofagų ir limfocitų, o ne uždegimo žymenų prasiskverbimu į audinius [40].
Priklausomai nuo ląstelių tipo, uždegimas yra skirstomas į ūminį ir lėtinį. Tačiau šis skirstymas taip pat turi netikslumų, nes, pavyzdžiui, gimdos raumenyje menstruacijų metu neutrofilai ir taip aptinkami [42]. Taigi, ūminio endometrito ir perimenstruacinės gimdos raumens būklės tokia citologinė diferencinė diagnostika galėtų būti kebli. Histologinis audinio ištyrimas turėtų būti auksinis standartas diagnozuojant uždegimą. Nustatyta, kad leukocitai tik chemotaksio veikiami pradeda migruoti į audinių pažeidimo arba infekcijos vietą, o molekuliniai uždegimo žymenys gali būti aptinkami daug anksčiau nei histologiškai patvirtinamas uždegimas [43, 44]. Ir tam nereikia paties audinio mėginio.
Laiku nustatyti uždegimą yra labai svarbu, nes ne visada šis procesas pasireiškia klinikiniais simptomais – karščiavimu, skausmu, leukocitoze ir kt. Kai kuriems histologinio uždegimo atvejams apskritai nebūdinga klinikinė išraiška.
Vienas iš tokių yra histologinis chorioamnionitas tiek išnešioto, tiek neišnešioto nėštumo metu [45, 46]. Tam pagelbėtų citokinų tyrimai.
Uždegimo reikšmė organizmui yra trejopa: 1) sudaryti fizinį infekcijos plitimo barjerą, 2) pristatyti ląsteles ir molekules infekcijos kenksmingumui panaikinti; 3) skatinti pažeistų audinių atsinaujinimą [41]. Molekulės, kurios atsipalaiduoja pažeidimo metu (citokinai, chemokinai, prostaglandinai, leukotrienai, komplemento sistema ir kt.) skatina reaktyvių deguonies metabolitų susidarymą, padidina makrofagų ir neutrofilų aktyvumą, dėl to mikroorganizmas tampa nekenksmingas [41]. Reaktyvių deguonies metabolitų perteklius organizme formuoja oksidacinį stresą, šis sudaro sąlygas sisteminiam uždegimui atsirasti, pavyzdžiui, sepsio ar preeklampsijos atvejais [47, 48].
Pavojingų signalų atpažinimas. Imuninė sistema pavojingiems signalams atpažinti naudoja struktūros atpažinimo receptorius (angl. pattern recognition receptors – PRRs), kurie identiškai atkartoja daugumos mikroorganizmų struktūrą [41,49]. Manoma, kad imuninė sistema greičiau reaguoja į pavojaus signalus iš pažeisto audinio nei į svetimo agento atpažinimą [49]. Pirmasis PRRs atpažinimas vyksta per transmebraninius receptorius (angl. Toll-like receptors – TLRs), kurie atpažįsta bakterijų endotoksinus. Jų yra ir makšties epitelyje, gimdos kaklelyje, gimdos gleivinėje, kiaušintakiuose [50]. Nustatyta, kad savaiminis pirmalaikis gimdymas, esant chorioamnionitui, ir padidėję receptorių TLR-2,- ir -4 mRNR kiekiai vaisiaus dangaluose yra susiję [51]. Tai rodytų, kad pakitęs įgimtas imuninis atsakas galėtų būti pirmalaikio gimdymo iniciatorius.
Įgimtas ir įgytas imuninis atsakas. Įgimtas imuninis atsakas yra nespecifinis ir neturi imunologinės atminties. Įgytas imuninis atsakas yra specifinis ir jam pasireikšti reikia laiko. Šiam atsakui būdinga imunologinė atmintis [41, 52].
Epiteliniai paviršiai yra pirmasis fizinis nespecifinis barjeras, saugantis nuo mikroorganizmų patekimo. Tačiau bakterijos gali „apeiti” epitelio barjerą. Klinikiniais tyrimais įrodyta, kad bakterijos gali patekti į vaisiaus vandenis per uždegiminius vaisiaus dangalus ir nesant jų plyšimo [53]. Epitelis taip pat gamina antimikrobinius peptidus (a,P-defensinus), kurie pažeidžia mikroorganizmų ląstelių membranas [54, 55]. Pavyzdžiui, vaisiaus plaučiuose gaminami surfaktanto baltymai SP-A, SP-D [56] taip pat pasižymi mikroorganizmus surišančiu ir uždegimą slopinančiu poveikiu [57]. Kitas nespecifinis veiksmas, kuris apsaugo nuo mikroorganizmų išplitimo, yra metabolinių komponentų prieš bakterijas išskyrimas. Pavyzdžiui, makštyje esančios laktobakterijos gamina pieno rūgštį, kuri stabdo patogeninių bakterijų augimą ir plitimą [58].
Labai svarbus nespecifinis imuninės sistemos atpažinimo mechanizmas yra atpažinimo receptoriai PRRs. Jie klasifikuojami: 1) tirpūs atpažinimo receptoriai -ūmios fazės proteinai (pvz., CRB); 2) transmembraniniai atpažinimo receptoriai (TLRs-1-10, C-lektinai). TLR-4 atpažįsta lipopolisacharidus, kuriuos gamina Gr (-) bakterijos; TLR-2 atpažįsta peptidoglikanus, lipoproteinus, kuriuos išskiria Gr (+) bakterijos, mikoplazmos; 2) intraląsteliniai atpažinimo receptoriai (Nod-1,2) atpažįsta intraląstelinius patogenus [59]. Sąveika su transmembraniniais atpažinimo receptoriais sukelia citokinų, chemokinų, antimikrobinių peptidų gamybą, aktyvinamos specifinio imuninio atsako ląstelės [41].
Citokinai ir chemokinai. Citokinai – tai imuninių ląstelių gaminamos polipeptidinės molekulės, kurios dalyvauja imuniniuose procesuose [60, 61]. M. Mitchell su bendraautoriais citokinus apibūdina kaip tirpius tarpląstelinių kontaktų tarpininkus [62]. Citokinų gyvavimo laikas yra gana trumpas. Nuolatinė citokinų gamybos stimuliacija yra būtina sąlyga, kad jų veikla nenutrūktų. Citokinai atlieka pagrindinį vaidmenį kontroliuojant uždegiminį atsaką. Jų veikla yra trejopa: 1) nespecifinio imuninio atsako reguliavimas; 2) specifinio imuninio atsako reguliavimas; 3) hemopoezės ląstelių augimo ir diferenciacijos reguliavimas.
Bendros citokinų klasifikacijos nėra. Citokinams priklauso įvairios heterogeninės molekulės, kurios pagal funkcinį aktyvumą yra skirstomos į: interleukinus, limfokinus, interferonus, kolonijas stimuliuojančius veiksnius, auglio nekrozės veiksnius (TNF), augimo veiksnius (GF), chemokinus ir kt. Kiekvienos rūšies citokinus sintetina skirtingos ląstelės. Citokinai veikia ląsteles taikinius, susijungdami su jų membranoje esančiais specifiniais receptoriais. Nustatyta, kad citokinai yra aktyvūs net esant labai mažoms jų koncentracijoms, matuojamoms pikomoliais, o jų veikla yra labai įvairialypė [60, 63].
Citokinai gali pasižymėti uždegiminiu (IFN-y, IL-1, IL-12, TNF-a) ar priešuždegiminiu poveikiu (IL-4, IL-10, IL-11, IL-12, TGF-P). A. K. Abbas su bendraautoriais siūlo skirti tris pagrindines citokinų grupes: įgimto nespecifinio imuniteto mediatoriai (TNF-a, IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a,-P, chemokinai); specifinio imuniteto mediatoriai (IL-4, IL-5, IFN-y, TGF-P, TNF-P); kraujodarą veikiantys citokinai (IL-3, IL-7, granulocitų kolonijas stimuliuojantis veiksnys G-CSF, monocitų kolonijas stimuliuojantis veiksnys M-CSF, kamieninių ląstelių veiksnys) [60, 64]. Citokinai gali būti klasifikuojami ir pagal kilmę: 1) T helperių tipas 1, arba TH1; 2) T helperių 2 tipas, arba TH2. TH1 citokinai (IFN-y, IL-2, TNF-a) atsakingi už ląstelinį imunitetą, TH2 citokinai (IL-4, IL-6, IL-10 ir IL-13) skatina humoralinio imuniteto veiklą.
Prouždegiminiai citokinai TNF-a, IL-1P – pagrindiniai sepsinio šoko vedliai, kurių klinikinė išraiška yra karščiavimas, hipotenzija, leukocitozė ir kt. [65, 66]. TNF-a skatina kitų citokinų sintezę. Šis citokinas gaminamas kepenyse, monocituose, makrofaguose. Jo skilimo pusperiodis yra tik 17 min. [67]. Eksperimentinių tyrimų duomenimis, TNF-a atlieka pagrindinį vaidmenį esant bakterijų LPS sukeltam smegenų pažeidimui [68, 69]. Naujausi tyrimai sieja ankstyvus ir vėlyvus neišnešiotų naujagimių smegenų pokyčius su padidėjusiomis TNF-a, IL-1P koncentracijomis [70-72].
IL-6 – ūmios uždegiminio atsako fazės žymuo, kuris skatina ūmios fazės reaktantų (pvz., CRB) gamybą kepenyse. IL-6 yra plejotropinis citokinas, apie 26 kDa dydžio, jį gamina fagocitai, endotelio ląstelės, fibroblastai, taip pat atkrintamosios plokštelės, choriono, vaisiaus dangalų ir trofoblasto ląstelės. Intrauterinės infekcijos sukelto pirmalaikio gimdymo atvejais padidėjusios IL-6 koncentracijos aptinkamos moters kraujo serume, vaisiaus vandenyse [73, 74]. Nustatytas virkštelės kraujo IL-6 koncentracijų ir chorioamnionito bei naujagimių sepsio tarpusavio ryšys [75]. Citokinai IL-1 [76], TNF-a [77], IL-6 [78], IL-8 keičia gimdos fenotipą, skatindami prostaglandinų biosintezę, ekstaceliulinės medžiagos destrukciją bei pasižymi neuroendokrininiu poveikiu, galų gale tai sukelia pirmalaikį gimdymą.
Infekcinės ar kitos kilmės pažeidimas sudaro sąlygas uždegimo grandinės pradžiai, kas skatina VEGF gamybą [79, 80]. Yra žinomi keli šio veiksnio pogrupiai – VEGF-A, -B, -C, -D, ir -E. VEGF jungiasi su ląstelių paviršiuje esančiais receptoriais [81]. Labiausiai ištirtas VEGF-A atlieka pagrindinį vaidmenį vystantis kraujagyslėms [80]. Tyrimai, siejantys VEGF koncentracijas kraujyje su naujagimio klinikiniais pokyčiais ankstyvuoju ir vėlyvuoju adaptacijos laikotarpiais, daugiausia minimi bronchų ir plaučių displazijos (BPD) kontekste [82-85]. Vėliau VEGF pradėtas sieti su neišnešiotų naujagimių retinopatijos (NNR) išsivystymu [86-88]. VEGF pats savaime nėra uždegiminis veiksnys. Jis gali inicijuoti uždegiminį atsaką centrinėje nervų sistemoje, kadangi didina hematoencefalinio barjero pralaidumą ir skatina imuninių molekulių ir kitų pažeidėjų patekimą į smegenis. Tai sudaro sąlygas neišnešiotų naujagimių intraskilvelinėms kraujosruvoms susidaryti [26]. Šis veiksnys ir jo receptoriai VEGS-R1,3 yra svarbūs normaliam kraujagyslių vystymuisi embriogenezės metu bei arterinio latako užsidarymui po gimimo [89]. Su VEGF siejami naujausi tyrinėjimai lėtinės plaučių ligos, NNR, smegenų pažeidimo linkme.

6.2 Uždegimas ir pirmalaikis gimdymas

Dažniausia pirmalaikio gimdymo priežastis yra infekcija – apie 40 proc. atvejų [90, 91]. Tyrimai rodo, kad kylančioji lytinių takų infekcija dažnai sukelia subklinikinį chorioamnionitą, pirmalaikį vaisiaus vandenų nutekėjimą ir pirmalaikį gimdymą [92]. Rečiau intrauterinė infekcija plinta hematogeniniu, peritoniniu keliu ar išsivysto po atliktos amniocentezės. Dažniausiai vaisiaus vandenis infekuoja Ureaplasma urealyticum ir Mycoplasma spp., rečiau Fusobacterium spp., Mycoplasma hominis, Str. agalactiae, Peptostreptococcus spp., St. aureus, Gardnerella vaginalis, E. coli, Enterococcus faecalis [93]. Net 51 proc. atvejų aptinkamas daugiau nei vienas sukėlėjas [94]. Duomenys apie viruso įtaką pirmalaikiam gimdymui yra prieštaringi. Vieni tyrėjai nepateikia aiškių viruso ir pirmalaikio gimdymo sąsajų, kitų autorių duomenimis, vaisiai, kurių vandenyse aptiktas viruso antigenas, dažniau žūdavo gimdoje, dažniau gimdavo prieš laiką ir būdavo mažesnio gimimo svorio [95]. Dažniausiai išskiriami adenovirusai, citomegalijos ir enterovirusai [96]. Yra pakankamai duomenų, rodančių, kad mikrobinė vaisiaus vandenų invazija neretai yra lėtinis ir kliniškai nebylus vidurinio nėštumo trečdalio procesas, galų gale pasibaigiantis pirmalaikiu gimdymu [97].
Manoma, kad tik 1 proc. visų mikroorganizmų leidžia aptikti bakteriologiniai pasėliai. Literatūroje nurodoma didesnė imunologinių tyrimų vertė, nes citokinų kiekio padidėjimas nustatomas dažniau, nei aptinkamos pačios bakterijos [44, 98].
Kylančiuoju būdu patekę mikroorganizmai sukelia vietinę uždegiminę reakciją ir uždegiminių citokinų gamybą. Jeigu šio proceso nepakanka tam, kad prasidėtų gimdymas, mikroorganizmai per vaisiaus dangalus patenka į vaisiaus vandenis, pasiekia vaisių, inicijuojamas VUAS [99]. Uždegiminių citokinų padaugėja motinos kraujo serume, vaisiaus vandenyse, vaisiaus kraujyje [100, 101].

Infekuotas vaisius, atsakydamas į stresą, „įjungia” autonominės nervų sistemos ir hormoninės sistemos veiklas, susidaro vadinamoji pogumburio, kankorėžinės liaukos ir antinksčių (HPA) ašis, kai vaisiaus pogumburyje suaktyvėja kortikoliberino sekrecija ir dėl to vaisiaus antinksčiuose padidėja kortizolio gamyba. Kortizolis tiesiogiai veikia prostaglandinų sekreciją, sukeliami gimdos susitraukimai. Tuo įrodoma, kad žmogaus vaisius pats gali duoti gimdymo pradžios signalą. Manoma, kad nepalanki intrauterinė aplinka sukelia ilgalaikes pasekmes HPA ašiai [106].
Tęsiant nėštumą yra labai svarbūs priešuždegiminiai citokinai. Manoma, kad IL-10 – svarbus priešuždegiminis veiksnys, palaikantis nėštumą. Išnešioto nėštumo atveju IL-10 gamyba placentoje yra sumažėjusi, palyginti su I ir II nėštumo trečdalio IL-10 kiekiais. Tai rodytų, kad IL-10 mažėjimas – normalus fiziologinis reiškinys, pasibaigiantis gimdymu [107]. IL-10 skyrimas gyvūnams pagerina nėštumo baigtį [108]. Žinoma, kad uždegiminis procesas išnešioto gimdymo metu apsiriboja vien vaisiaus dangalais. Motinos kraujo serume šių uždegimo žymenų neaptinkama [109].

6.3 VUAS – sunkiausia intrauterinės infekcijos išraiška

Pirmųjų daugiau nei prieš penkis dešimtmečius atliktų vaisiaus imuninės sistemos tyrimų duomenys rodė, kad vaisiaus imunitetas pasižymi imunotolerancija [110]. Vėliau pastebėta, kad prieš laiką nutekėjus vaisiaus vandenims, neišnešioto vaisiaus neutrofilai ir monocitai visgi pasižymi imunoaktyviu poveikiu [111], tokio vaisiaus kraujo plazmoje aptinkamos padidėjusios IL-6 [10] ir CRB [112] koncentracijos ir fiksuojamas TH1 ir TH2 imuninis atsakas [113]. 1993 m. neurologas iš Bostono A. Levitonas iškėlė hipotezę, kad intrauterinė infekcija vaisiuje inicijuoja uždegiminių citokinų gamybą, kurie galbūt sukelia smegenų baltosios medžiagos pažeidimą, vadinamą periventrikuline leukomaliacija (PVL) [114]. Po kelerių metų B. H. Yoon su bendraautoriais patvirtino šią hipotezę [24, 115].
Intrauterinė infekcija, pasiekusi vaisių, inicijuoja VUAS. Dažniausiai tai yra subklinikinė būklė, daugiau siejama su pirmalaikiu gimdymu ir pirmalaikiu vaisiaus vandenų nutekėjimu [116]. VUAS progresuodamas sukelia poliorganinį pažeidimą, sepsinį šoką ir mirtį [117]. VUAS – sisteminio uždegiminio atsako sindromo (SUAS), aprašomo suaugusiems žmonėms, atitikmuo. 1992 m. Amerikos krūtinės ląstos gydytojų kolegija ir Intensyviosios terapijos sąjunga patikslino ir apibrėžė SUAS klinikinius ir laboratorinius kriterijus [118]. Nuo 2001 m. IL-6 apibūdinamas kaip laboratorinis SUAS žymuo [119].
VUAS apibrėžiamas IL-6 koncentracijos padidėjimu vaisiaus kraujo plazmoje >11 pg/ml [120, 10]. Naujagimiai, kuriems buvo diagnozuotas VUAS, dažniau sirgo KSS, naujagimių sepsiu, pneumonija, BPD, nekroziniu enterokolitu, jiems dažniau buvo diagnozuotos intraskilvelinės kraujosruvos ir PVL [10]. Uždegimo žymenys IL-1, TNF-a. padidina hematoencefalinio barjero pralaidumą, skatina oligodendrocitų pažeidimą ir sutrikdo mielino gamybą. B.H. Yoon su kolegomis nustatė, kad 88 proc. atvejų PVL yra susijusi su padidėjusiais TNF-a, IL-1, IL-6 kiekiais naujagimio smegenyse [121].
Literatūros duomenimis, motinai uždegimas nustatomas 9 kartus dažniau, nei randama vaisiaus uždegiminė reakcija žuvus vaisiui gimdoje. Vaisiaus mirtis, kurios priežastis yra infekcija gimdoje, suprantama kaip imuninio atsako į infekcijos plitimą klaida, dėl kurios neprasidėjo pirmalaikis gimdymas [50, 116]. Manoma, kad antenatalinė vaisiaus žūtis gali būti susijusi ir su IL-1ra geno 2 alelio defektu, kai labai padidėja IL-1ra gamyba ir stabdoma pirmalaikio gimdymo pradžia [122].

6.4 VUAS ir vaisiaus poliorganinis pažeidimas

Mikrobinė invazija vaisiuje inicijuoja sisteminį uždegiminį atsaką, kuris progresuodamas sutrikdo daugelio organų veiklą. Daugiasistemis pažeidimas vystosi dėl vaisiaus kraujo plazmoje padidėjusių metaloproteinazių-9 koncentracijų, kurios suardo IV tipo kolageno skaidulas [105]. VUAS organai taikiniai yra hemopoezės sistema, antinksčiai, širdis, smegenys, plaučiai, oda ir žarnynas [43, 123].
VUAS ir hemopoezės sistemos pažeidimas. Labiausiai VUAS sutrikdo eritrocitų ir granulocitų grandis [124]. Dviem trečdaliams pažeistų vaisių būdinga neutrofilija. Manoma, kad tai atsitinka dėl G-CGF, kurio, esant VUAS, vaisiaus kraujo plazmoje padaugėja daugiau nei 10 kartų. VUAS pažeistų vaisių kraujyje dažnai randama ir eritroblastų. Kai kurie autoriai teigia, kad vaisiaus kraujo eritroblastų kiekis ir virkštelės kraujo IL-6 koncentracijos yra susiję [125].
VUAS metu pakinta monocitų ir neutrofilų aktyvumas [111]. Naujausi tyrimai rodo VUAS ir vaisiaus čiobreliaukės sunykimo sąsajas [126]. Manoma, kad dėl citokinų poveikio vaisiuje padidėja gliukokortikoidų gamyba, kas sukelia limfoidinio audinio ląstelių apoptozę. J. D. Kuban su bendraautoriais nustatė uždegimo, mažų vaisiaus čiobreliaukės rengenologinių matmenų ir vaisiaus smegenų baltosios medžiagos pažeidimo tarpusavio ryšį [127].
VUAS ir vaisiaus antinksčių pažeidimas. Paaiškėjo, kad VUAS streso pažeistam vaisiui pasikeičia kortizolio ir dehidroepiandrosterono (DHEA-S) santykis. Nustatytas šio santykio ir IL-6 ryšys [128]. Manoma, kad tokie pokyčiai turi ilgalaikius padarinius žmogaus metabolinėms funkcijoms [129, 130].
VUAS ir vaisiaus odos pažeidimas. Literatūros duomenimis, esant chorioamnionitui vaisiaus odoje padidėja TLR-2 kiekiai. Taip įrodomas vaisiaus odos vaidmuo uždegiminio atsako patogenezėje [131].
VUAS ir vaisiaus inkstų pažeidimas. Tyrimai rodo, kad, įvykus PVVN ir esant mažam vaisiaus vandenų kiekiui, dažniau nustatomos padidėjusios virkštelės kraujo IL-6 koncentracijos bei didesnės IL-6, IL-10 ir TNF-a koncentracijos vaisiaus vandenyse [132]. Manoma, kad dėl uždegimo atsiradę inkstų kraujotakos sutrikimai lemia mažesnę vaisiaus vandenų gamybą [133]. Nustatyta, kad dėl perinatalinės uždegiminės reakcijos įvykę nefronų pokyčiai išlieka ir vaikui augant, pavyzdžiui, mikroalbuminurija. Todėl tokiems vaikams inkstų funkcijos rodmenys turėtų būti tiriami reguliariai.
VUAS ir vaisiaus širdies pažeidimas. Atlikti tyrimai rodo, kad įvykus PVVN, keičiasi vaisiaus širdies diastolės funkcija [134]. Manoma, kad taip atsitinka dėl padidėjusio kairiojo širdies skilvelio komplainso, kuris suprantamas kaip kompensacijos mechanizmas, siekiant palaikyti pastovų širdies minutinį tūrį. Vaisiaus sepsio atveju vyksta stiprus širdies raumens pažeidimas, dėl to vaisius gali žūti [135]. Nustatyta, kad sunkus naujagimių hemodinamikos sutrikimas tiesiogiai siejasi su padidėjusiomis virkštelės kraujo IL-6 koncentacijomis [136]. Manoma, kad šie sunkūs hemodinamikos pokyčiai gali vykti ir vaisiui, kas lemia PVL ir nepalankias neurologines baigtis [137].
VUAS ir vaisiaus plaučių pažeidimas. Pirmąjį eksperimentinį tyrimą, įrodantį antenatalinės uždegiminės reakcijos įtaką vaisiaus plaučių būklei, aprašė K. Bry su bendraautoriais [138]. Buvo nustatyta, kad IL-1a injekcijos į vaisiaus vandenis pagerina triušių naujagimių plaučių funkcijas, nes padidėja surfaktanto A ir B baltymų frakcijų bei surfaktanto lipidų kiekiai. Šie pastebėjimai rodytų, kad uždegimas vaisiaus plaučiuose pagreitina plaučių audinio brendimą. Tuo pat metu K. L. Watterberg su kolegomis nustatė histologinio chorioamnionito ir retesnio ūmaus naujagimio KSS tarpusavio ryšį, tačiau LPL, vėliau vadintos BPD, atvejai buvo dažnesni. Tyrimo metu trachėjos aspirate pirmą gyvenimo parą nustatytos padidėjusios IL-1 P koncentracijos [139].
Dešimtmečiu anksčiau buvo pastebėta, kad Ureaplasma urealyticum (Uu), kuri įprastai aptinkama apatiniuose lytiniuose takuose, iš trachėjos aspirato dažniau buvo išskiriama tiems naujagimiams, kuriems vėliau vystėsi LPL, todėl manyta, kad infekuoti vaisiaus vandenys turi poveikį distalinių plaučių audinio segmentų vystymuisi [140]. Ši prielaida padaryta dar iki surfaktanto eros. Ir tik daug vėliau nustatyta, kad Uu ir Mycoplasma hominis vikštelės kraujyje aptinkamos net 23 proc. labai neišnešiotų vaikų, kuriems dažnai buvo diagnozuojami naujagimių SUAS ir BPD [141].
Infekcijos vaidmuo LPL patogenezėje nagrinėjamas ir tolau [142]. Didėjant LPL dažniui (7,5-20 proc. naujagimių < 34 gestacijos sav. [143]), buvo nustatyta, kad naujagimiai, kurių vaisiaus vandenyse ir virkštelės kraujyje rastos padidėjusios uždegiminių citokinų koncentracijos, turi polinkį išsivystyti LPL. Taigi, šis polinkis gali būti nulemtas iki gimimo ir glaudžiai susijęs su VUAS [82,84]. Ankstesnių tyrimų duomenys rodė, kad BPD išsivysto vaikams, kuriems buvo sunkus KSS, ir jam gydyti reikėjo didelio ventiliacijos slėgio ir didelės deguonies koncentracijos. Pastarųjų metų tyrimai rodo, kad „naujoji" BPD dažniau formuojasi naujagimiams, kuriems antenataliai plaučių brandinimui buvo skirti kortikosteroidai, po gimimo buvo skirta surfaktanto bei pritaikyta moderni neagresyvi mechaninė plaučių ventiliacija. Anksčiau daryta prielaida, kad BPD formavimąsi lemia didelis neišnešiotumas, barotrauma, deguonies toksiškumas, buvo papildyta nauja hipoteze: neadekvati plaučių raida dažniausiai yra antrinė, nulemta intrauterinės infekcijos ir vaisiaus uždegiminės reakcijos [82, 144]. B. H. Yoon su bendraautoriais įrodė, kad IL-6, IL-8, IL-ip koncentracijas vaisiaus vandenyse ir naujagimių BPD sieja tiesioginis ryšys [145]. Taip pat buvo nustatytas VUAS, kai virkštelės kraujo IL-6 >17,5 pg/ml, ir „atipinės” lėtinės plaučių ligos (LPL be ūminio naujagimių KSS) tarpusavio ryšys [146].
Uždegiminius citokinus atsakydamos į hiperoksijos, mikroorganizmų, endotoksinų, barotraumos poveikį, gamina ir plaučių audinio ląstelės. Tai sukelia plaučių audinio pažeidimą ir fibrozinius pokyčius [147]. Manoma, kad uždegiminiai citokinai prasiskverbia giliai į neišnešiotų naujagimių plaučius dėl nepakankamo priešuždegiminių citokinų (IL-4, IL-10, IL-11 ir kt.) gebėjimo reguliuoti šį uždegiminį atsaką iš karto po gimimo [142, 147], todėl didėja BPD išsivystymo galimybė [148, 149]. Neišnešiotų naujagimių antioksidacinių fermentų (superoksido dismutazės, katalazės ir glutationo peroksidazės) aktyvumas yra mažas [150], tačiau audinių proteazių (metaloproteinazės-9, elastazės ir kt.) aktyvumas yra pakankamas, kad pažeistų ekstraceliulinį karkasą bei alveolės ir kapiliaro jungtį [151]. Neišnešioto naujagimio audinai turi mažai ir proteazių inhibitorių. Kita vertus, nustatyta, kad genetiškai nulemtas šių fermentų trūkumas taip pat sukelia plaučių audinio ląstelių žūtį, nes metaloproteinazės pasižymi ir audinio struktūros apsauginiu poveikiu [152, 153].
Kitas uždegimui būdingas požymis yra padidėjęs alveolių ir kapiliarų pralaidumas [144]. A. Jaarsma su bendraautoriais nustatė, kad uždegimo žymenys pažeidžia smulkiųjų plaučių kraujagyslių vientisumą jau pirmą dirbtinės plaučių ventiliacijos valandą [154]. Padidėję albumino kiekiai kvėpavimo takuose sukelia plaučių edemą, pažeidžia surfaktanto sistemą [155]. Dėl plaučių kraujagyslių endotelio pažeidimo padidėja neutrofilų ir trombocitų aktyvumas, kas rodo jau sisteminį uždegiminio atsako pobūdį [156]. Dėl uždegimo atsiradusį plaučių pažeidimą visada lydi TGF-p\ CTGF ir VEGF funkcijų pokyčiai [144]. TGF-p1 ir CTFG skatina audinių atsinaujinimą. Kai audinių atsinaujinimo procesas pasidaro pernelyg intensyvus, inicijuojamas fibrozinio audinio formavimasis ir BPD vystymasis [157, 158]. Šie abu veiksniai yra įtraukti ir į „naujos” BPD patogenezę, kuri apibūdinama ne tiek fibroziniais plaučių pokyčiais, kiek bendrai sumažėjusiu plaučių audinio ir plaučių kraujagyslių augimu. Mažos VEGF koncentracijos randamos vaikams, kuriems diagnozuojama BPD [159, 160]. Susilpnėjus VEGF ir jo receptorių veiklai, netaisyklingai formuojasi mikrokraujagyslių tinklas ir sutrinka alveolizacija.
Apibendrinant būtų galima teigti, kad perinatalinis uždegimas pagreitina vaisiaus plaučių brendimą, dėl to gerėja naujagimių išgyvenamumas įvykus pirmalaikiam gimdymui. Kita vertus, uždegiminei reakcijai įgavus lėtinę eigą, plaučiuose sukeliami giluminiai pokyčiai, kurie programuoja patologinę plaučių vaskulogenezę ir alveolizaciją, dėl to išsivysto LPL [43].
VUAS ir CNS pažeidimas. Smegenų pažeidimą gali sukelti asfiksija, smegenų infekcija ar perinatalinė uždegiminė reakcija. 1950 m. N. J. Eastman įrodė karščiavimo gimdymo metu ir vaikų cerebrinio paralyžiaus ryšį [161]. Tokiais atvejais vaikai cerebriniu paralyžiumi sirgo septynis kartus dažniau. Pastarojo dešimtmečio tyrimai pateikia akivaizdžių įrodymų dėl intrauterinės infekcijos vaidmens vystantis naujagimių ISK ir PVL [120, 121, 162-164].
PVL dažniausiai siejama su neišnešiotu naujagimiu [122, 165]. Tačiau paskelbti tyrimai įrodo, kad chorioamnionitas yra nepriklausomas cerebrinio paralyžiaus rizikos veiksnys išnešiotiems ar nedaug neišnešiotiems vaikams [166, 167]. Virkštelės kraujagyslių uždegimas – funizitas taip pat susiejamas su nepalankiomis neurologinėmis baigtimis [168, 169].
Anksčiau manyta, kad vaikų cerebrinis paralyžius – hipoksijos gimdymo metu padarinys, tačiau tolesni tyrimai parodė, kad tik 8-10 proc. atvejų cerebrinis paralyžius susijęs su įvykiais gimdymo metu. Pateikiami aiškūs kriterijai, pagal kuriuos cerbrinis paralyžius galėtų būti siejamas su gimdymu: 1) virkštelės arterijos kraujo pH < 7,0 ir šarmų deficitas >12 mmol/l; 2) didelio ar vidutinio laipsnio encefalopatija >34 nėštumo savaičių naujagimiams; 3) spastinio tetrapleginio ar diskinezinio pobūdžio cerebrinis paralyžius [170]. Tuo pat metu O. Damanas ir A. Levitonas patvirtina, kad intrauterinės infekcijos sukeltas vaisiaus uždegiminis atsakas susijęs tiek su neišnešioto naujagimio ISK, tiek su baltosios smegenų medžiagos pažeidimu ir nervų sistemos vystymosi sutrikimais [171, 172]. Šie pastebėjimai įrodo, kad didėjantys virkštelės kraujo citokinų kiekiai, kaip atsakas į prenataliai patekusį antigeną, atsiranda daug anksčiau nei hipoksija ar smegenų pažeidimas gimdymo metu.
Specifinis mechanizmas, kaip intrauterinė infekcija ir jos sukelta vaisiaus uždegiminė reakcija pažeidžia smegenis, nėra iki galo aiškus. Kai kurių tyrimų duomenimis, naujagimių, kuriems diagnozuota PVL, baziniuose mazguose, smegenų gumbure, hyppocampus ir neocortex zonose randamos padidėjusios TNF-a, IL-6, IL-ip ir IL-2 koncentracijos [173-175]. Žinoma, kad lipopolisacharidas sumažina oligodendrocitų pirmtakų ir mielino bazinio baltymo kiekį, dėl to besivystančiose smegenyse sumažėja mielino gamyba [176]. Citokinų gamyba vyksta ir vaisiaus mikroglijoje, sukeliama astrogliozė [174]. Dėl uždegimo didėja azoto oksido sintezė, ciklooksigenazės gamyba, todėl padaugėja laisvųjų radikalų [177]. Citokinai susilpnina ir glutamato nešiklių funkciją, todėl įvykęs oksidacinis stresas pažeidžia neuronus [178].
Citokinai aptinkami ir vaisiaus kraujotakoje, ir smegenyse. Hipoksinio ischeminio ir uždegimo nulemto smegenų pažeidimo mechanizmai yra panašūs [179, 180]. Smegenys, įvykus hipoksijai – ischemijai (pvz., sunkios preeklampsijos atvejais), taip pat gamina citokinus, nors infekcijos ir nėra. IL-1P, TNF-a kiekių padidėjimas fiksuojamas 1-4 val. po hipoksijos ir ischemijos fakto [181]. Tokiais atvejais virkštelės kraujo citokinų tyrimai galėtų padėti diferencijuoti, kada galėjo įvykti smegenų pažeidimas – iki gimdymo ar gimdymo metu. Nustatyta, kad neišnešiotų ir išnešiotų vaikų, kuriems diagnozuotas cerebrinis paralyžius, virkštelės kraujo citokinų charakteristikos skiriasi, todėl manoma, kad cerebrinio paralyžiaus patologinė fiziologija įvairuoja priklausomai nuo gestacijos [182].
2005 m. K. B. Nelsonas su bendraautoriais nustatė neišnešiotų vaikų genetinio polimorfizmo ir cerebrinio paralyžiaus ryšį [183]. Genetinio polimorfizmo svarba cerebrinio paralyžiaus formavimuisi minima ir kitų tyrėjų darbuose [184].
Literatūros duomenimis, PVL dažnis yra apie 7 proc. mažesniems nei 32 nėštumo savaičių naujagimiams [185], B. H. Yoon nurodo 14 proc. PVL dažnį 25¬36 sav. naujagimiams [26]. Dėl baltosios smegenų medžiagos pažeidimo vaikui augant išryškėja kai kurių sutrikimų: ribotos aplinkos pažinimo galimybės, elgsenos sutrikimai, vaizdo suvokimo sunkumai ir cerebrinis paralyžius [4, 186, 187]. Todėl būtų galima teigti, kad VUAS įvardijimas galėtų pagelbėti nustatant šių sutrikimų priežastį.
Publikuotų tyrimų, kuriuose nurodomos perinatalinės uždegiminės reakcijos ir neišnešiotų naujagimių raidos sąsajos, nėra daug. Vienuose tyrimuose virkštelės kraujo citokinai apskritai nebuvo tiriami, kituose uždegimo žymenys buvo tiriami naujagimio motinai ar naujagimiui pirmomis gyvenimo dienomis, todėl tyrimų rezultatų interpretacija kiek skiriasi. Kūdikių raidos vertinimas taip pat buvo atliekamas naudojant skirtingas raidos vertinimo metodikas. Pavyzdžiui, JAV daugiau nei septynis dešimtmečius vaikų raidai įvertinti naudojama Bayley vaikų vystymosi skalė (angl. Bayley Scales of Infant Development – BSID) [188]. Raidos įvertinimas pagal BSID metodiką yra sudėtingas ir reikalauja atitinkamos raidos vertinimo specialistų kvalifikacijos ir šio metodo naudojimo patirties. Kitose šalyse kūdikių raidai įvertinti paplitę Denverio raidos atrankos testas (angl. Denver developmental screening test – DDST), Albertos motorinio vaikų vystymosi skalė (angl. Alberta Infant Motor Scale – AIMS) ir kiti testai, iš kurių 18 yra dažniausiai naudojamų [189, 190]. Mūsų tyrime buvo taikyta Miuncheno funkcinės raidos diagnostikos metodika [191 ], kuri yra daug paprastesnė.
VUAS ir naujagimių nekrozinis enterokolitas. Liteatūros duomenimis, IL-18, TNF-a, IL-12 ir nekrozinis enterokolitas (NEK) naujagimystėje yra susiję.
IL-18 – kritinis citokinas NEK patogenezėje, kuris paleidžia uždegiminę kaskadą [192]. Kepenų TNF-a ir IL-18 atpalaiduoja kitus citokinus, per biliarinę sistemą patenka į žarnyną ir sukelia jo pažeidimą [193]. Nustatyta, kad gyvūnai, kuriems buvo skirta specifinių TNF-a antikūnių, penkis kartus rečiau sirgo NEK
[194]. Tyrimo metu buvo padaryta prielaida, kad specifiniai TNF-a antikūniai, kurie inaktyvina ne tik TNF-a, bet ir kitus kepenų ir žarnyno citokinus, galėtų būti skiriami žmonėms gydyti. Nustatyta, kad motinos pienas didina priešuždegiminio citokino IL-10 kiekį žarnyne, todėl NEK išsivystymo rizika mažėja [195].
Neišnešiotų naujagimių retinopatija ir VUAS. Maždaug prieš dešimtmetį buvo įvardyti NNR rizikos veiksniai: maža nėštumo trukmė, mažas naujagimio gimimo svoris, gydymas deguonimi po gimimo [196]. Vėliau NNR susieta su vitamino E trūkumu, paciento gydymu indometacinu, hiperkapnija, kraujo ir jo komponentų perpylimais [197]. Tačiau neišnešiotumas ir gydymas deguonimi buvo pripažinti svarbiausiais etiologiniais NNR veiksniais [198]. Tik 2009 m. O. Damanas susiejo NNR su chorioamnionitu [199].
Daugumoje publikacijų, kuriose apžvelgiama NNR patogenezė, teigiama, kad gydymas didele deguonies koncentracija turi neigiamą poveikį nebrandžiai tinklainei, nes mažėja VEGF kiekis, dėl ko tinklainės kraujagyslės nustoja augti [200]. Ir atvirkščiai, esant hipoksijai VEGF kiekiai tinklainėje gerokai padidėja, todėl joje prasideda pernelyg intensyvus kraujagyslių augimas ir vystosi NNR. Literatūroje nurodomi ir genetiniai NNR atsiradimą skatinantys veiksniai [201]. Tačiau kai kuriuose tuo pat metu atliekamuose tyrimuose konstatuojama, kad infekcija naujagimystės laikotarpiu didina NNR atsiradimo riziką [202, 203]. Iškeliama hipotezė: jei hipoksija ir infekcija naujagimystės laikotarpiu ir NNR yra susijusios, tai anksčiau, prieš gimimą, įvykęs oksidacinis stresas ir perinatalinė uždegiminė reakcija taip pat galėtų lemti NNR atsiradimą [204].
Manoma, kad ypač neurotrofiškas TNF-a yra įtrauktas į NNR patogenezę. Nustatyta, kad omega-3 polinesočiųjų rūgščių, kurios mažina TNF-a kiekį audiniuose, skyrimas mažina tinklainės avaskulinės zonos dydį [205]. Tai būtų galima aiškinti tuo, kad tinklainė tam tikra prasme yra ir neurogeninės kilmės audinys, kurį lokaliai gali paveikti įvairūs neurotrofiniu, angiogeniniu ir uždegiminiu poveikiu pasižymintys veiksniai. Taigi, tam tikri neurotrofiniai veiksniai, įtraukti į uždegiminį procesą, veikia ir akies struktūrą.
Pirmasis perspektyvusis didelės imties tyrimas, kurio metu NNR susieta su perinataliniu uždegimu, publikuotas 2010 metais. Tyrime dalyvavo 870 naujagimių, kurių gimo svoris buvo < 1000 g [206]. Nustatyta, kad naujagimių, kuriems buvo diagnozuota NNR, 8 citokinų (IL-6, IL-17 ir kt.) koncentracijos kraujyje pirmas tris gyvenimo savaites reikšmingai skyrėsi nuo naujagimių, kurie nesirgo NNR. Tuo pačiu laikotarpiu atliktame tyrime M. Chen su bendraautoriais nustatė, kad uždegimas perinataliniu laikotarpiu labiau didina NNR atsiradimo riziką 28-29 nėštumo savaičių naujagimiams nei gydymas deguonimi 23-25 nėštumo savaičių naujagimiams [207]. Virkštelės kraujo citokinai šiuose tyrimuose nebuvo tiriami. Taigi, šiandien manoma, kad neišnešiotumas kartu su prouždegiminiais komponentais (chorioamnionitu, naujagimio SUAS) didina NNR atsiradimo galimybę. Publikacijose taip pat minima, kad reikalinga daugiau perspektyviųjų panašaus dizaino tyrimų. Tai sudarytų galimybes anksti diagnozuoti ir gydyti vaistais ankstyvos stadijos NNR. Manoma, kad tokiu būdu būtų galima sumažinti chirurginio NNR gydymo apimtis. VUAS sąsajos su kitomis ligomis. Su perinataline uždegimine reakcija gali būti siejamas ir vaisiaus intrauterinis augimo sulėtėjimas (IUAS). Dažna IUAS priežastis yra placentos nepakankamumas, kurį galėtų lemti ir imunologiniai veiksniai. Kai kurie autoriai teigia, kad per didelis atkrintamosios plokštelės ląstelių imunitetas gali sukelti preeklampsiją ir vaisiaus IUAS [208]. Yra duomenų, kad esant IUAS mikrobinė vaisiaus vandenų invazija molekulinės diagnostikos būdu randama apie 6 proc. atvejų [209], o preeklampsijos atvejais net 9,6 proc. [210]. Todėl, diagnozavus šias būkles, būtų tikslinga ieškoti uždegimo žymenų. Kai kurie tyrėjai esant IUAS ir sutrikusiai placentacijai motinos kraujo plazmoje nustatė padidėjusias TNF-a ir kitų citokinų koncentracijas [211, 212]. Proangiogeninių ir antiangiogeninių veiksnių disbalansas preeklamsijos ir vaisiaus IUAS atvejais yra labai svarbus [213-215]. Todėl uždegimo žymenų nustatymas galėtų būti vertingas prognozuojant placentos funkcijos nepakankamumą ir IUAS. 2006 m. M. Dashash atlikti tyrimai nurodo IL-10 ir kūdikių staigios mirties sindromo ryšį. Yra prielaidų, kad šio sindromo patogenezei gali turėti reikšmės nepakankama kai kurių citokinų gamyba. Sindromas siejamas su plaučių raidos ypatumais, nustatytas su IL-6 ir VEGF gamyba susijusių genų polimorfizmas [216]. Atopija vaikystėje taip pat siejama su tam tikrais uždegiminių citokinų veiklos ypatumais. Paaiškėjo, kad nustatyti IL-13 koncentraciją virkštelės kraujyje yra svarbu prognozuojant atopijos išsivystymą vaikystėje [217]. Manoma, kad uždegiminė intrauterinė aplinka sukelia ilgalaikes pasekmes HPA ašiai. Pastarąjį dešimtmetį labai susidomėta imuninių žymenų įtaka neuropsichiatrinių ligų patogenezei. Kai kurių psichiatrinių būklių metu nustatomi padidėję uždegiminių citokinų kiekiai. 1997 m. B. B. Mittelman su bendraautoriais paskelbė duomenis, kad TNF-a koncentracijos smegenų skystyje buvo reikšmingai didesnės tų pacientų, kuriems buvo diagnozuotas hiperaktyvumo sindromas, dėmesio sutrikimai ir įvairios persekiojimo būklės [218]. Vėliau atsirado duomenų, kad padidėjusios IL-6, IL-1 P, TNF-a koncentracijos periferiniame kraujyje aptinktos tiems pacientams, kuriems buvo diagnozuota depresija, anoreksija, miego sutrikimai ir neurodegeneracinės ligos [219, 220]. Manoma, kad uždegiminiai citokinai, patekę į CNS, sutrikdo serotonino metabolizmą, kas sąlygoja elgesio, miego ir apetito sutrikimus, nuotaikų svyravimą ir agresiją [221]. 2006 m. V. Babulas su bendraautoriais paskelbė tyrimą, kurio metu buvo išanalizuoti 7794 gimdymai. Nustatyta, kad motinų, kurios pastojimo metu sirgo lytinių takų infekcija, vaikai šizofrenija serga penkis kartus dažniau nei sveikų mamų [222]. Vėliau, 2007 m., N. M. Ponzio susiejo vaikų polinkį sirgti autizmu su tam tikrais motinos imuninės būklės ypatumais nėštumo laikotarpiu [223]. Literatūros duomenimis, per pastarąjį dešimtmetį autizmo spektro ligų labai padaugėjo, todėl kai kurie tyrėjai rekomenduoja atlikti šių sutrikimų rutininę atranką ikimokyklinio amžiaus vaikams [224, 225]. 2009 m. paskelbti labai mažos gestacijos (<28 sav.) 1506 naujagimių daugiacentrio tyrimo duomenys [226]. Šiems naujagimiams dvejų metų koreguotame amžiuje atliktas testas autizmo rizikai įvertinti - M-CHAT. Net 21 proc. tirtų naujagimių autizmo rizikos testas buvo teigiamas. Tyrimo metu nustatytas šių sutrikimų ir placentos mikrobiologinių ir uždegiminių pokyčių tarpusavio ryšys. 6.5 VUAS prevencija ir gydymo perspektyvos VUAS - neprikausomas naujagimių sergamumo rizikos veiksnys. Antibakterinis gydymas, pirma laiko nutekėjus vaisiaus vandenims, yra nepakankama strategija siekiant pagerinti situaciją vaisiaus uždegiminės reakcijos atveju. 2007 m. paskelbti tyrimai įrodė, kad tokiais atvejais antibiotikų skyrimas retai iki galo išnaikina infekciją. Nustatyta, kad trečdaliui tokių pacienčių, kurioms atvykus uždegimo požymių nenustatyta, išsivystė intraamnioninė infekcija, nors buvo skirta antibiotikų [227]. Tyrėjai padarė prielaidą, kad per ilgas nėštumo tęsimas, įrodžius intrauterinę infekciją, net ir skiriant agresyvų antibakterinį gydymą, gali būti kenksmingas ne tik moteriai, bet ir naujagimiui. Todėl, neišnešiotumo komplikacijų ir intrauterinės infekcijos pasekmių rizika turi būti labai pasverta ir subalansuota. Vaisiaus plaučių brandinimui skiriamas deksametazonas gali sumažinti intraskilvelinių kraujosruvų dažnį ir sunkumo laipsnį, taip pat apsaugoti nuo LPL [228]. Antenatalinis antibiotikų ir imunomoduliatorių (deksametazono ir indometacino) skyrimas gyvūnams stabdo infekcijos plitimą, sumažina uždegiminį atsaką, ilgina gestacijos laiką [229]. Tačiau neigiamo kortikosteroidų poveikio nebrandžioms smegenims taip pat nereikėtų pamiršti. Kitos VUAS patogenezinio gydymo perspektyvos taip pat pagrįstos tik atliekant tyrimus su gyvūnais. Oligotrofinai, priešuždegiminiai citokinai (IL-10), citokinus surišantys antikūniai, citokinų receptorių blokatoriai ir antioksidantai galėtų apsaugoti baltąją smegenų medžiagą nuo pažeidimo [193, 230-232]. Ištirtas N-acetilcisteino apsauginis vaidmuo. Skiriant šio preparato prenataliai, mažėja uždegimo sukelta oligodendrocitų pirmtakų degeneracija, stabdoma TNF-a, azoto oksido sintezė [233, 234]. Melatoninas, kuris yra stiprus antioksidantas, taip pat saugo periventrikulinę smegenų zoną nuo pažeidimo [235]. Aktyvintas C baltymas - antikoaguliacinis veiksnys, pasižymi uždegimą slopinančiomis, apoptozę stabdančiomis savybėmis. Rekombinantinio aktyvinto C baltymo injekcijos į pilvaplėvę mažina uždegiminių citokinų gamybą, skiriant žiurkėms tiek antenataliniu laikotarpiu, tiek pirmos paros jaunikliams [236]. Eritropoetinas (EPO), įprastai skiriamas mažakraujystei gydyti, atlieka svarbų vaidmenį vystantis nervų sistemai, ją apsaugant ir atsinaujinant. EPO ypač saugo dopaminerginius neuronus, kurių sutrikusi funkcija susijusi su hiperaktyvumo sindromu vaikystėje. EPO taip pat saugo nuo patologinės neovaskuliarizacijos, kartu ir nuo retinopatijos [237]. Didelės EPO dozės pereina hematoencefalinį barjerą, skatina neuronų pirmtakų proliferaciją, glijos ir endotelio ląstelių diferenciaciją, mažina TNF-a, IL-6 poveikį [238, 239]. Klara ląstelių baltymas CC10 - neseniai surastas priešuždegiminis agentas, mažina TNF-a, IL-8 kiekį plaučiuose, esant mekonijaus aspiracijai. CC10 taip pat saugo surfaktantą nuo suirimo. Neišnešiotiems naujagimiams trūksta CC10. Skiriant rekombinantinio CC10-surfaktanto junginio, mažėjo plaučių ir sisteminio uždegimo sukeltas KSS. Šis derinys galėtų sumažinti ilgalaikės dirbtinės plaučių ventiliacijos ir uždegiminio atsako nulemtas komplikacijas [240, 241]. Tyrimuose su gyvūnais įrodyta, kad azitromicinas mažina IL-6 kiekį audiniuose. Skiriant azitromicino, plaučiuose mažėja emfizeminiai pakitimai, kartu ir BPD rizika [242]. Nustatyta, kad vitaminas C pasižymi citokinų TNF-a, IL-6 veiklą slopinančiu poveikiu [243]. Nustatytas diazoksido, skatinančio ologodendrocitų pirmtakų proliferaciją, poveikis nebrandžioms smegenims in vitro ir in vivo [244]. 2009 m. D. J. Webber su bendraautoriais paskelbė savo tyrimo rezultatus, kur minima, kad gyvūnų modelyje oligodendrocitų pirmtakų transplantacija yra efektyvi gydant PVL [245]. Šis tyrimas parodo, kad tiek nervinių ląstelių pirmtakų, tiek kamieninių ląstelių [246] persodinimas yra perspektyvus ir žmonių PVL gydymo metodas. Apibendrinant būtų galima teigti, kad VUAS yra labiau pažengęs ir sudėtingesnis procesas, nei tradiciškai vertinami su intrauterine infekcija susiję mikrobiologiniai tyrimai. Siekiant sumažinti pirmalaikių gimdymų skaičių, mokslinių tyrimų dėmesio centre atsidūrė imunologinių tyrimų taikymas intrauterinės infekcijos sukeltam pirmalaikiam gimdymui numatyti. Ryšys tarp perinatalinio uždegimo, pirmalaikio gimdymo ir grėsmingų naujagimystės komplikacijų turėtų būti stiprus stimulas pasirenkant pirmalaikio gimdymo priežiūros taktiką. Per ilgas pirmalaikio gimdymo sulaikymas gali būti pavojingas ne tik vaiko sveikatai naujagimystės laikotarpiu, bet ir vaikui augant. Nurodoma, kad citokinų tyrimai būtų vertingi diagnozuojant naujagimiui sisteminį uždegiminį atsaką tais atvejais, kai yra infekcijos klinikinių požymių, bet kraujo ir smegenų skysčio pasėliai yra neigiami. Ateityje būtų tikslinga taikyti neinvazinius tyrimų metodus, kurie galėtų padėti diagnozuoti VUAS in utero. Tai suteiktų galimybių gydyti vaisių iki gimimo, siekiant jį apsaugoti nuo smegenų pažeidimo ir kitų VUAS komplikacijų. Tiksli VUAS diagnostika galėtų padėti planuoti gimdymo terminą. Literatūroje paskelbtų duomenų apie VUAS įtaką neišnešioto naujagimio sveikatai ir tolesnei raidai stoka paskatino suformuluoti šio mokslinio tyrimo tikslus ir uždavinius. Mūsų darbo tikslas buvo nustatyti VUAS rizikos veiksnius, ištirti ir įvertinti VUAS reikšmę neišnešioto naujagimio sveikatai ankstyvuoju ir vėlyvuoju adaptacijos laikotarpiais bei raidai 6 mėnesių ir 1 metų koreguotame amžiuje. Kad atsakytume į šiuos klausimus ištyrėme 158 naujagimius ir jų mamas. 7. TYRIMO OBJEKTAS 7.1 Tyrimo metodologija Tyrimo objektą sudaro virkštelės kraujo citokinų ir 22-34-ą nėštumo savaitę gimusių naujagimių sveikatos iki vienerių metų koreguoto amžiaus (KA) tyrimai. Perspektyvusis atvejo - kontrolės tyrimas vykdytas Vilniaus miesto klinikinėje ligoninėje (VMKL) ir Vaikų ligoninės Vilniaus universiteto ligoninės Santariškių klinikų filialo (VL VULSKF) Neonatologijos centre 2007-2010 metais. Imunologiniai virkštelės kraujo tyrimai atlikti Valstybiniame mokslinių tyrimų institute Inovatyviosios medicinos centre pagal toliau aprašytą protokolą (8.1 skyrius). 6 ir 12 mėnesių KA kūdikių psichomotorinės raidos įvertinimas pagal Miuncheno funkcinės raidos diagnostikos metodiką atliktas VL VULSKF Neonatologijos centre. Naujagimių (vėliau kūdikių) ištyrimas vyko keturiais etapais: I etapas -pirmą gyvenimo savaitę (n=158); II etapas - išvyksatant iš stacionaro - 36-37 postkoncepcinio amžiaus savaitę (n=149); III etapas - 6 mėnesių KA (n=131); IV etapas - 12 mėnesių KA (n=144). Visi naujagimiai tirti pagal tą pačią schemą: 1) išnagrinėti naujagimių klinikiniai, instrumentiniai ir laboratoriniai rodmenys; 2) atlikti virkštelės kraujo citokinų tyrimai. Priklausomai nuo virkštelės kraujo IL-6 koncentracijos, tiriamieji priskirti VUAS (IL-6 > 11 pg/ml, n=52) arba kontrolinei (IL-6 < 11 pg/ml, n=106) grupei (7.2 skyrius), palyginti abiejų grupių klinikiniai, instrumentiniai, laboratoriniai rodmenys visais tyrimo etapais; 3) įvertinta naujagimių raida ir antropometriniai rodmenys 6 ir 12 mėnesių KA; 4) nustatyta virkštelės kraujo citokinų vertė prognozuojant neišnešioto naujagimio sveikatos sutrikimus. Papildomai išanalizuoti naujagimių motinų socialiniai, ekonominiai, anamnezės ir akušeriniai duomenys. Kiekvieno naujagimio ir jo motinos duomenys apibendrinti specialiai tyrimui parengtoje anketoje (1 priedas). 7.2 Tiriamasis kontingentas Tiriamąjį kontingentą sudarė nuo 2007 metų liepos iki 2009 metų sausio VMKL gimę 22-34 nėštumo savaičių naujagimiai ir jų motinos. Įtraukimo į tyrimą kriterijai: 1) gimdyvės amžius >18 m; 2) nėštumas 22-34 sav. ir 6 dienos; 3) normaliai prisitvirtinusi placenta; 4) gimdyvė neserga cukralige, lėtinėmis širdies – kraujagyslių ir kvėpavimo sistemos ligomis, sunkia mažakraujyste (Hb <80 g/l), autoimuninėmis ir onkologinėmis ligomis. Neįtraukimo į tyrimą kriterijai: 1) negyvagimis; 2) gimdyvės alkoholizmas, narkomanija; 3) naujagimio sklaidos trūkumai; 4) hemolizinė naujagimių liga; 5) virkštelės arterijos kraujo pH <7,00; 6) naujagimiui diagnozuota gimdymo trauma; 7) moters nesutikimas dalyvauti tyrime. Gydymas naujagimiams buvo skiriamas pagal sveikatos priežiūros įstaigos gydymo algoritmus. Tyrimas atliktas gavus Lietuvos bioetikos komiteto patvirtintą leidimą (2007¬06-20 Nr.14). Visos naujagimių motinos sutikimą dalyvauti tyrime patvirtino raštu. Imunologinius virkštelės kraujo tyrimus finansavo Lietuvos valstybinis mokslo ir studijų fondas (2008-04-07 Nr. T-101/08). 8. TYRIMO METODIKA Pirmajame ir antrajame tyrimo etapuose visiems naujagimiams ir jų motinoms buvo atliekami įprasti klinikiniai, laboratoriniai ir instrumentiniai tyrimai. Naujagimių neurosonoskopijos tyrimas atliktas naudojant „GE LOGIQ 3 expert" ultragarsinį aparatą bei GE 7,5 MHz konvekcinį daviklį. Duomenys buvo surinkti iš ligos istorijų ir apibendrinti tyrimo anketoje. 8.1 Virkštelės kraujo imunologinis tyrimas 8.1.1 Virkštelės kraujo bandinių ruošimas Naujagimiui gimus, punktuota virkštelės vena. Į vakuuminį mėgintuvėlį atitraukta 5 ml kraujo. Paimtas kraujo bandinys ne vėliau kaip per 1 val. buvo centrifuguojamas 14 min. 1500 aps./min. greičiu VMKL laboratorijoje. Kraujo plazma buvo išpilstoma į 1,5 ml mikromėgintuvėlius ir laikoma -80 °C temperatūroje iki kiekybinio citokinų tyrimo. 8.1.2 Virkštelės kraujo citokinų IL-6, bTNF-a, bVEGF-A, aTNF-a, aVEGF-A koncentracijų nustatymas Kiekybiniam virkštelės venos kraujo citokinų tyrimui naudoti komerciniai IL-6, TNF-a, VEGF-A ELISA rinkiniai (Human IL-6, TNF-a total, VEGF-A total, Bender MedSystems, Austrija). Aktyvūs TNF-a ir VEGF-A buvo nustatomi naudojant komercinius TNF-a ir VEGF-A BioLISA rinkinius (Human TNF-a, VEGF-A BioLISA, Bender MedSystems, Austrija). ELISA ir BioLISA tyrimų rezultatai buvo vertinami 450 nm bangos ilgio spektrofotometru (BioTek Instrments, JAV). Tiriamų bandinių citokinų koncentracijos buvo apskaičiuojamos pagal kiekviename tyrime gautas standartines kreives, naudojant specialią ELISA rezultatų įvertinimo programą Gen5 Microplate Data Collection & Analysis Software (BioTek Instruments, JAV). Kiekybinis citokinų IL-6, bTNF-a, bVEGF tyrimas virkštelės kraujo serume imunofermentiniu (ELISA) metodu. Visų trijų rinkinių naudojimo metodikos yra labai panašios, skiriasi tik standartinių tirpalų ruošimas, todėl jas aptarėme kartu. Visuose rinkiniuose 96 šulinėlių mikroplokštelės yra padengtos antikūnais, specifiniais žmogaus citokinams IL-6, TNF-a arba VEGF. Rinkiniuose esantys liofilizuoti citokinų standartai (rekombinantiniai baltymai IL-6, TNF-a arba VEGF) prieš tyrimą buvo atskiedžiami distiliuotu vandeniu: - IL-6 standarto pagrindiniu tirpalu iki 200 pg/ml, paruošiant 7 darbinius standartų tirpalus nuo 100 pg/ml iki 1,56 pg/ml standartinei kreivei paruošti; - TNF-a standarto pagrindiniu tirpalu iki 3000 pg/ml, paruošiant 7 darbinius standartų tirpalus nuo 1500 pg/ml iki 23 pg/ml; - VEGF standarto pagrindiniu tirpalu iki 4 ng/ml, paruošiant 7 darbinius standartų tirpalus nuo 2000 pg/ml iki 31 pg/ml. Visi rinkinyje esantys reagentai buvo paruošiami iki darbinių koncentracijų ir sušildomi iki kambario temperatūros (19-24 oC). Tiriami kraujo serumo bandiniai taip pat buvo sušildomi iki kambario temperatūros ir švelniai sumaišomi. Bandiniai buvo skiedžiami 1:2 rinkinyje esančiu analizės (Assay) buferiu. Darbiniai standartų tirpalai ir tiriami serumų bandiniai buvo išpilstomi po 50 ul į atitinkamus plokštelės šulinėlius, į kuriuos prieš tai įpilama 50 ul analizės buferio (2 kartų praskiedimas). Į visus šulinėlius taip pat buvo įpilama po 50 ul biotino konjugato. Plokštelė buvo apdengta specialia prilimpančia plėvele ir inkubuojama 2 valandas 19-24 oC temperatūroje ant mikroplokštelių purtyklės, nustačius 100 aps./min. Inkubavimo metu bandiniuose esantys citokinai yra surišami šulinėlių dugne specifiniais imobilizuotais antikūniais. Po inkubavimo plokštelių šulinėliai buvo plaunami keturis kartus, naudojant po 400 ul rinkinio sudėtyje esančio plovimo buferio. Išplovus nesusirišusius tiriamų bandinių komponentus, į visus šulinėlius buvo įpilama po 100 ul streptavidino ir krienų perosidazės (Streptavidin-HRP) tirpalo. Plokštelė vėl buvo uždengiama ir inkubuojama 1 val. kambario temperatūroje ant purtyklės. Paskui plokštelių šulinėliai vėl buvo plaunami keturis kartus plovimo buferiu ir įpilama po 100 ul tetrametilbenzidino (TMB) substrato, vėl inkubuojama apie 10- 20 min. tamsoje kambario temperatūroje, stebint aukščiausio standarto spalvą arba išmatuojant reakcijos intensyvumą ELISA spektrofotometru. Fermentinė reakcija buvo sustabdoma, įpilant į šulinėlius 100 ųl stabdančio tirpalo. Sustabdžius fermentinę reakciją, 450 nm bangos ilgio ELISA spektrofotometru buvo matuojamas optinis tankis (OT). Gauti plokštelių OT rezultatai buvo apdorojami statistiškai. Pirmiausia iš visų plokštelių OT reikšmių buvo atimama nulinio standarto (be citokinų) reikšmė, tada grafiniame popieriuje buvo nubrėžiamos standartinės kreivės, pažymint x ašyje standartų koncentracijas, o y ašyje - gautas absorbcijos (OT) reikšmes. Per gautus taškus nubrėžiama kreivė ir apskaičiuojamos tiriamų mėginių citokinų koncentracijos. Keliuose tiriamuose serumuose IL-6 koncentracija viršijo standartinės kreivės didžiausią reikšmę, todėl jie buvo papildomai ištirti skiedžiant serumus santykiu 1:10. Darbe panaudotų rinkinių jautrumas IL-6 nustatymo diagnostikai buvo ne mažiau kaip 0,92 pg/ml, bTNF-a - ne mažiau kaip 5,0 pg/ml, bVEGF - ne mažiau kaip 14,0 pg/ml. Kiekybinis aTNF-a ir aVEGF tyrimas virkštelės kraujo serume imunofermentiniu metodu. Metodo BioLISA atlikimas praktiškai nesiskiria nuo citokinų IL-6, bTNF-a ir bVEGF nustatymo metodo, todėl detaliai nepateikiamas (žr. IL-6, bTNF-a ir bVEGF tyrimas). Serumai taip pat buvo skiedžiami du kartus (VEGF- 4 kartus) rinkiniuose esančiu Assay buferiu. Pirma serumo bandinių su biotino konjugatu padengtuose receptoriais šulinėliuose inkubacija buvo atliekama mėginius per naktį laikant 4 oC temperatūroje (šaldytuve). Tyrimas tęstas kitą rytą. Rinkiniuose esantys liofilizuoti citokinų standartai prieš tyrimą buvo praskiedžiami distiliuotu vandeniu: - TNF-a standarto pagrindiniu tirpalu iki 2000 pg/ml, paruošiant 7 darbinius standartų tirpalus nuo 1000 pg/ml iki 16 pg/ml standartinei kreivei paruošti; - VEGF-A standarto pagrindiniu tirpalu iki 2000 pg/ml, paruošiant 7 darbinius standartų tirpalus nuo 1000 pg/ml iki 16 pg/ml. Gauti OT rezultatai buvo apskaičiuojami remiantis specialia rezultatų įvertinimo programa. Darbe panaudotų rinkinių jautrumas buvo ne mažesnis nei 7,26 pg/ml. 8.2 6 ir 12 mėnesių koreguoto amžiaus kūdikių antropometriniai tyrimai Kūdikių kūno masė buvo matuojama medicininėmis svarstyklėmis (SOEHNLE, Vokietija, tikslumas ± 5g), ūgis - standartiniu horizontaliuoju ūgio matuokliu (tikslumas ± 5 mm), galvos apimtis - standartine centimetrine juostele, laikantis įprastinių reikalavimų. Jei kūdikio gimimo svoris buvo mažesnis nei 1500 g, vadovavomės amerikiečių mokslininkų rekomenduojamomis augimo kreivėmis [247], jei kūdikio gimimo svoris buvo >1500 g, – Lietuvoje patvirtintomis kūdikių augimo kreivėmis [248].

8.3 Psichomotorinės raidos vertinimas pagal Miuncheno funkcinės
raidos diagnostikos metodiką

Kūdikiai buvo tiriami budrumo būsenos, praėjus maždaug 1-2 valandoms po paskutinio maitinimo, ramioje ir gerai apšviestoje patalpoje, esant 19-24 °C temperatūrai. Tyrimo metu dalyvavo kūdikio motina arba kitas artimas žmogus. Priklausomai nuo tirtos funkcinės srities, kūdikis paguldytas ant pilvo, ant nugaros arba laikytas sėdimoje padėtyje ar stačias. Funkcinės sritys tikrintos kruopščiai stebint atitinkamas reakcijas. Esant reikalui, reakcijos išprovokuotos. Vertinant bendrosios motorikos funkcijas, kūdikis tirtas be drabužėlių. Naudotos standartinės testo priemonės: varpelis, raudonas barškutis, spalvotas 12 cm skersmens žiedas, vienspalviai mediniai kubeliai, lėlė, tuščiaviduris kubelis, medžiaginis vystyklas, medinis automobilis su virvute, popierius.
Šešių mėnesių KA kūdikiams vertinta šių funkcinių sričių raida: ropojimo, sėdėjimo, vaikščiojimo, griebimo, suvokimo, kalbėjimo ir socialinės srities. Dvylikos mėnesių kūdikiams buvo vertinamas ir kalbos supratimas.
Pagal funkcinių sričių tarpusavio ryšį, kūdikių raidos sutrikimas priskirtas vienai iš keturių sutrikimų grupei: 1) judesių raidos sutrikimas; 2) smulkiųjų judesių raidos sutrikimas; 3) psichosocialinės raidos sutrikimas; 4) mišrus kūdikio raidos sutrikimas.
8.4 Statistinė duomenų analizė
Imties tūriui nustatyti buvo pasitelkta Cochrane duomenų bazės siūloma formulė:
z2v(1-v)
n=
A2
Prieš pradedant tyrimą nustatyta, kad chorioamnionito kartu su funizitu -histologine VUAS išraiška – paplitimas esant neišnešiotiems gimdymams VMKL buvo apie 10 proc., tai 1,9620,1(1-0,1)
n=
0,052
Gavome, kad imties tūris, kai paplitimas 10 proc., n = 138 užtikrina populiaciją su ±5 proc. paklaida, esant 95 proc. patikimumui. Įtraukti 158 naujagimiai.
Nustatėme neurosonoskopijos rodmenų, oftalmologo, kvėpavimo sistemos būklės vertinimų ir baigties statistinį galingumą, kai pirmos rūšies klaida a=0,05

Nustatyta tyrimo antros rūšies klaida P<0,15 rodo, kad skirtumas tarp grupių yra statistiškai reikšmingas ir tyrimo imtis yra pakankama Statistinė duomenų analizė atlikta standartinėmis statistinėmis programomis SPSS 15.0 versija ir STATISTIKA 6.0 versija. Tolydiems dydžiams vertinti taikytos šios statistinės charakteristikos: vidurkis (V), min, max, mediana, standartinis nuokrypis (SN), 95 proc. pasikliautinasis intervalas (PI). Tikrinat hipotezes apie parametrų pasiskirstymo normalumą naudotas Kolmogorovo ir Smirnovo testas. Dviejų nepriklausomų grupių kiekybiniams kintamiesiems palyginti taikytas parametrinis Stjudento t ir neparametrinis Mano ir Vitnio testas, o daugiau nei dviem grupėms palyginti taikyta dispersinė analizė ANOVA. Daugkartiniams poriniams palyginimams naudoti aposteriorinis Bonferoni (angl. post hoc) bei Kruskalo ir Voliso testai. Dviem priklausomiems kiekybiniams požymiams palyginti taikėme parametrinį porinį Stjudento ir neparametrinį Vilkoksono testą. Kokybinių požymių tarpusavio priklausomumą vertinome chi kvadrato (x ) kriterijumi. Tiesinė kintamųjų priklausomybė vertinta naudojant koreliacijos koeficientą. Atsižvelgiant į kintamųjų skirstinį, buvo taikomas Pirsono ar Spirmeno koreliacijos koeficientas. Tikrinat statistines hipotezes, reikšmingumo lygmuo pasirinktas 0,05. Tyrimų jautrumas ir specifiškumas, pasirenkant kritines citokinų vertes, buvo skaičiuojamas analizuojant ROC kreives. Tyrimo kritinės vertės buvo skaičiuojamos kiekvienam slenksčio taškui (cut-off). Tyrimo metodų tikslumas vertintas pagal ROC kreivės apibrėžtą grafinį plotą S, esantį po kreive. Kai S reikšmė buvo didesnė nei 0,5, metodas laikytas tinkamas diagnostikai. Daugiaveiksnės logistinės regresijos žingsniniu (backward stepwise) metodu nustatyti veiksniai, kurie prognozuoja VUAS. Į logistinės regresijos modelį buvo įtraukti tie veiksniai, kurie reikšmingai paveikė arba turėjo tendenciją paveikti (p<0,15) VUAS išsivystymą vienaveiksnės analizės metu. Kiekvienam rizikos veiksniui apskaičiuotas galimybių santykis (GS) ir jo 95 proc. PI. Įvertinus naujagimių gestacijos amžių, naujagimių sveikatos sutrikimų reliatyvioji rizika (RR) nustatyta remiantis vienaveiksniu ar daugiaveiksniu Kokso regresijos modeliu. 11. TYRIMO IŠVADOS 1. Nepriklausomi nėščiosios rizikos veiksniai vaisiaus uždegiminio atsako sindromui išsivystyti yra: nėštumo trukmė 30 savaičių ir mažesnė; kūno temperatūra prieš gimdymą 37 °C ir daugiau; histologiškai patvirtintas chorioamnionitas (su funizitu ar be jo) ar deciduitas; endometritas po gimdymo. 2. Naujagimiams, kuriems įtartas vaisiaus uždegiminio atsako sindromas (virkštelės kraujo IL-6 >11 pg/ml), naujagimystės laikotarpiu didėja sunkaus naujagimių kvėpavimo sutrikimų sindromo, sunkaus centrinės nervų sistemos pažeidimo, vidutinės ir sunkios neišnešiotų naujagimių retinopatijos, mirties ir psichomotorinio vystymosi atsilikimo 12 mėn. koreguotame amžiuje reliatyvioji rizika.
3. Nustatytas virkštelės kraujo citokinų IL-6 ir bTNF-a koncentracijų bei sunkaus naujagimių kvėpavimo sutrikimų sindromo, sunkaus centrinės nervų sistemos pažeidimo, vidutinės / sunkios neišnešiotų naujagimių retinopatijos, naujagimių mirties bei 6 ir 12 mėn. koreguoto amžiaus kūdikių psichomotorinės raidos atsilikimo tarpusavio ryšys. Virkštelės kraujo aVEGF koncentracijas, 6 ir 12 mėn. koreguoto amžiaus kūdikių galvos apimtį, 12 mėn. koreguoto amžiaus kūdikių psichosocialinę raidą taip pat siejo tarpusavio ryšys.
4. Tyrime nustatytos virkštelės kraujo citokinų kritinės vertės, reikšmingos numatant neišnešioto naujagimio sveikatos ir psichomotorinės raidos iki 12 mėn. koreguoto amžiaus prognozę.
12. PRAKTINE TYRIMO REIKŠME
12.1 Darbo rezultatų praktinė reikšmė
Ištyrę virkštelės kraujo citokinų koncentracijas ir išanalizavę 22-34-ą nėštumo savaitę gimusių naujagimių sveikatą ankstyvuoju ir vėlyvuoju adaptacijos laikotarpiais bei psichomotorinę raidą 6 ir 12 mėnesių koreguotame amžiuje bei jų motinų sveikatos rodmenis, nustatėme, kad:
• VUAS galima įtarti ir numatyti grėsmingas komplikacijas naujagimiui, įvertinus nėščiosios rizikos veiksnius. Įvykus pirmalaikiam gimdymui, kai nėštumas yra 30 savaičių ir mažesnis, būtų tikslinga įvertinti moters kūno temperatūros pokyčius iki gimdymo, atlikti bendrąjį kraujo tyrimą, nustatyti kraujo CRB koncentraciją ir ištirti placentą. Histologiškai patvirtintas funizitas būtų rimtas signalas įtarti VUAS. Laikotarpiu po gimdymo tikslinga moterį stebėti dėl endometrito.
• Virkštelės kraujo citokinų koncentracijų tyrimas yra tinkamas ir informatyvus metodas prognozuojant neišnešioto naujagimio sveikatą po gimimo ir baigtį bei psichomotorinę raidą 12 mėnesių koreguotame amžiuje. Šiai prognozei būtų tikslinga ištirti virkštelės kraujo citokinų IL-6 ir bTNF-a. koncentracijas.
• Dažniausia tyrimo metu nustatyta virkštelės kraujo IL-6 kritinė vertė prognozuojant sunkius naujagimio sveikatos pokyčius ir psichomotorinės raidos atsilikimą 12 mėn. koreguotame amžiuje buvo >13 pg/ml. Prognozuojant 12 mėn. koreguoto amžiaus kūdikiui judesių raidos atsilikimą nustatyta virkštelės kraujo IL-6 kritinė vertė buvo >6,2 pg/ml, t. y. mažesnė už VUAS apibrėžime nurodomą IL-6 kritinę vertę >11 pg/m. Mūsų nustatytų virkštelės kraujo IL-6 kritinių verčių prognozinė vertė buvo didesnė, nei literatūroje nurodomos virkštelės kraujo IL-6 kritinės vertės >11 pg/ml.
12.2 Neišnešiotų naujagimių virkštelės kraujo citokinų tyrimų rekomendacijos

Rizikos naujagimių atrankai tikslinga būtų nustatyti citokinų TL-6 ir bTNF-a koncentracijas virkštelės kraujyje ir įvertinti naujagimio sveikatos sutrikimų riziką remiantis 46 lentele. Sudarius tikslinę rizikos naujagimių grupę, būtų galima planuoti kryptingą gydymą iš karto po gimimo ir numatyti reikiamų specialistų dalyvavimą vertinant ir koreguojant vaiko raidą ateityje.

Darbo autorius: I. Pilypienė

Atsiųsti pilną darbą vaisiaus-uzdegiminis-atsakas