Su augalais susiję mikroorganizmai geba skatinti augalų augimą tiesiogiai ir netiesiogiai. Tiesioginis augalų augimo skatinimo poveikis yra bakterijų gebėjimas išskirti hormonus (auksinus, giberelinus, citokininus, abscizinę rūgštį), tirpdyti fosfatus, fiksuoti atmosferos azotą, gaminti sideroforus. Netiesioginis augalų augimo skatinimas yra bakterijų gebėjimas gaminti ir išskirti patogenus slopinančius antimikrobinius junginius, tokius kaip antibiotinės medžiagos, lakieji junginiai, antriniai metabolitai, fermentai.

Šiame darbe buvo tiriama 15 pušų spyglių paviršiaus bakterijų (epifitų) siekiant nustatyti jų antagonistines ir su netiesioginiu augalų augimo skatinimu susijusias savybes.

Šiam tikslui pasiekti, buvo atliktas epifitinių bakterijų poveikio laboratorinėms testinėms kultūroms Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium (SL 1344), Staphylococcus aureus tyrimas. Rezultatai parodė, kad bakteriniai epifitiniai kamienai gebėjo slopinti arba skatinti testinių kultūrų augimą. Taip pat buvo atlikti epifitinių bakterijų tarpusavio sąveikų tyrimai. Nustatyti keli atvejai, kuomet epifitinis kamienas gebėjo antagonistiškai įtakoti kito epifito augimą, tačiau dauguma jų neveikė vienas kito augimo.
Darbo metu buvo siekiama nustatyti, ar tiriami epifitai geba slopinti plačiai paplitusių Saccharomyces cerevisiae mielių padermės aRN1 augimą. Atlikus tyrimą nustatyta, kad tiriamos epifitinės bakterijos neveikė mielių augimo.

Epifinių bakterijų gebėjimas išskirti fermentus buvo nustatytas atlikus fermento chitinazės testą. Šia savybe pasižymėjo dauguma tirtų kultūrų (10 iš 15 – os). Taip pat epifitai geba išskirti ir antrinį metabolitą vandenilio cianidą, tačiau šia savybe pasižymėjo mažiau tirtų kultūrų (2 iš 15 -os).

Atlikus molekulinius epifitinių bakterijų tyrimus buvo nustatyta jų rūšinė įvairovė. Iš tirtų epifitų daugiausia nustatyta Pseudomonas genties kultūrų (77 %).

Su augalais susijusių mikroorganizmų įvairovę lemia filogenezė, jų poveikis augalams, bei aplinka. Bakterijos gali užimti tokias augalo dalis kaip spermosfera, rizosfera, filosfera, indų ir vidinius audinius (Beattie, 2006).
Labiausiai dominuojanti augalo dalis – lapai (spygliai). Bakterijos geba plisti ir daugintis ant lapo paviršiaus veikiami aplinkos sąlygų, bei sąveikaudami su pačiu augalu. Tokia aplinka vadinama filosfera, o jos gyventojai – epifitai arba filobakterijos (Gnanamanickam, Ebenezar Immanuel, 2006).
Duomenų apie spygliuočių mikroorganizmus ir jų galimą panaudojimą augimo skatinimui ar biokontrolei nėra daug. Nustatyta, kad spygliuočio Araucaria angustifolia (Brazilinė araukarija) rizobakterijos geba išskirti augimą skatinantį hormoną indolil-3-acto rūgštį, tirpdyti neorganinį fosfatą, gaminti sideroforus, bei antagonistiškai veikti grybelio Fusarium oxysporum augimą (Ribeiro, Cardoso, 2012). Daug tyrimų atlikta veikiant spygliuočius įvairiomis bakterijų padermėmis, pavyzdžiui, Pseudomonas, kurių dėka galima padidinti sodinukų biomasę (Shishido, Chanway, 1999). Kiek anksčiau buvo aprašytas pušų bei eglių sodinukų augimas ir grybelinės infekcijos plitimas paveikus Bacillus padermėmis. Nustatyta, kad tirtosios Bacillus padermės neturėjo įtakos spygliuočių mikorizei, tačiau skatino sodinukų augimą (Shishido ir kt., 1996).
Labai mažai žinoma apie spygliuočių filosferos bakterijų sąveikas, augimo skatinimą, bei panaudojimą prieš patogenus. Juniperus procera (Tamsusis kadagys) spyglių mikroflorą sudaro bakterijos, aktinomicetai, mielės ir filamentiniai grybeliai. Tokiam paplitimui įtakos turi ne tik lapo amžius, bet ir vietovė, kurioje augalas auga (Alamri, 2008). Vienas iš biotechnologinio panaudojimo pavyzdžių gali būti Pinus nigra filosferos Pseudomonas bakterijos. Į jas įterpus Bacillus thuringiensis toksino geną cry9a gaunamas būdas apsaugoti spygliuočius nuo vabzdžių -parazitų (Alberghini ir kt., 2008).
Šio darbo tikslas yra nustatyti pušų filosferos epifitinių bakterijų antagonistines, bei su augalų augimo skatinimu susijusias savybes.

Uždaviniai:
1. Ištirti epifitinių bakterijų ir jų sekretuojamų medžiagų poveikį testinėms Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium (SL 1344), Staphylococcus aureus kultūroms.
2. Atlikti epifitinių bakterijų tarpusavio sąveikos tyrimus.

3. Nustatyti, ar tiriamosios epifitinės bakterijos geba išskirti galinčius slopinti grybų augimą junginius fermentą chitinazę ir vandenilio cianidą, bei ištirti epifitinių bakterijų sekretuojamų medžiagų poveikį mielėms Saccharomyces cerevisiae (aRN1).
4. Atlikti epifitinių bakterijų molekulinius tyrimus ir jas identifikuoti.

Darbas pristatytas 7-ojoje Tarptautinėje mokslinėje konferencijoje „The Vital Nature Sign” 2013 m. gegužės 16 – 19 d.

1. LITERATŪRA

1. 1. Augalų mikroorganizmai

Labiausiai dominuojantys mikroorganizmai augaluose yra bakterijos, priskiriamos prokariotams. Bakterijos gali siekti 109 ląstelių grame šaknų audinio skaičiuojant kultivavimu paremtais metodais, ir 1010 ląst./ g taikant nepriklausomus nuo kultivavimo metodus. Eukariotų mikroflorą gali sudaryti filamentiniai grybai, mielės, dumbliai, pirmuonys ir nematodai, bet dažniausiai jų tankumas mažesnis nei prokariotų. Pavyzdžiui, rizosferoje gali būti 106 – 109
7 5 6 3 2 3
neaktinomicetinių bakterijų, 10 aktinomicetų, 10 – 10 grybų, 10 dumblių ir 10 -10 pirmuonių. Bakteriofagai ir virusai taip pat gali sudaryti bendruomenes užimdami 10 – 10 ląst./ g dirvožemio.

1. 1. 1. Augalų ir mikroorganizmų sąveikos

Pastaruosius dešimtmečius daug dėmesio skiriama nustatyti teigiamą mikroorganizmų įtaką augalams tam, kad būtų padidintas jų produktyvumas.
Augalų prokariotai gali būti skirstomi į grupes pagal jų sąveikų tipus. Bakterijos, kurios nesąveikauja su augalais, klasifikuojamos kaip komensalai; tos, kurios turi teigiamą efektą augalui, vadinamos mutualistais; o tos, kurios įtakoja augalą neigiamai, vadinamos patogenais arba parazitais. Esama mikroorganizmų, nepriskiriamų nė vienam tipui, pavyzdžiui, rūšys galinčios panaudoti tik pasyviai iš augalo išskirtas maistines medžiagas; skatinančios aktyvių maistinių medžiagų išskyrimą be matomo poveikio augalui; galinčios indukuoti medžiagų išskyrimą iš augalo su nežymiu augalo pažeidimu. Tas pats organizmas vienam šeimininkui gali būti simbiontas, kitam patogenas, arba pirmus mėnesius būti simbiontu, o vėliau patogenu. Labiausiai paplitę yra komensaliniai santykiai, tačiau visi su augalais susiję mikroorganizmai, panašu, su augalu sudaro ir simbiontinius santykius tam tikru jų gyvenimo metu.
Atskirose augalo dalyse vyksta skirtingos mikrobiologinės sąveikos. Filosferos bendruomenė yra sudaryta iš kelių taksonų, kurie turi palyginti didelį skaičių individų, arba iš daug taksonų su mažu kiekiu individų. Pavyzdžiui, tarp 1701 iškirtų kultūrų iš alyvuogių lapų, didžiausią dalį sudarė Pseudomonas syringae, tuo tarpu kiekvienas kitas taksonas sudarė mažiau nei 10 %. Tarp kultūrų, išskirtų iš cukrinių runkelių lapų, surinktų pasibaigus augimo sezonui, nė vienas taksonas nesudarė daugumos. Taigi, galima teigti, kad filosferos mikroorganizmų bendruomenių dydis priklauso nuo augalo rūšies, lapo fiziologijos, amžiaus ir aplinkos sąlygų. Legard ir kt. (1994) pateikė taksonominės įvairovės pavyzdį, kuomet iš pavasarių kviečių lapų, surinktų pasibaigus augimo sezonui, buvo iškirtos 37 mikroorganizmų gentys ir 88 rūšys. Tarp iš lapų iškirtų kultūrų gramneigiamosios bakterijos yra labiau paplitusios negu gramteigiamosios.
Svarbiausi augalams yra mutualistiniai mikroorganizmai, turintys aiškią ir tiesioginę naudą augalui, pavyzdžiui, fiksuojantys atmosferos azotą, iškiriantys fitohormonus, taip pat veikiantys netiesiogiai slopindami patogenų poveikį (Beattie, 2006).
Bakterijos geba tiesiogiai skatinti augalų augimą išskirdamos tokius hormonus kaip auksinai, citokininai, giberelinai ir abscizinė rūgštis. Su stresu susijusi etileno sintezė gali būti slopinama 1-aminociklopropano-1-karboksilato (ACC) diaminazės. Taip pat kai kurios bakterijos geba fiksuoti atmosferos azotą ar tirpdyti fosfatus taip aprūpindamos augalus maistinėmis medžiagomis. Mikroorganizmai gali parūpinti apsaugą prieš patogenus indukuodami augalų apsaugos mechanizmus, išskirdami antagonistines medžiagas ar kovodami su jais dėl maistinių medžiagų (Reinhold – Hurek, Hurek, 2011).
Augalų hormonas etilenas, stiprus augalų augimo ir vystymosi reguliatorius, atlieka pagrindinį vaidmenį augalo ląstelės metabolizme. Etilenas svarbus augalo atsparumui ligoms, mikroorganizmų – augalo sąveikai, bei reakcijai į abiotinį stresą. Iš išorės paveikus etilenu, ar jo pirmtaku ACC, daugelyje ankštinių augalų slopinamas Rhizobium plitimas. Endofitinis Klebsiella pneumoniae kamienas 342 daug intensyviau kolonizuoja etilenui nejautrius Medicago trunculata mutantus negu normalaus genotipo augalus. Pridėjus etileno inhitoriaus 1-metilciklopropeno, padidėja normalaus genotipo M. trunculata kolonizacija šiomis bakterijoms, o pridėjus ACC -sumažėja. Šie rezultatai rodo, kad etilenas yra pagrindinis augalų audinių kolonizacijos bakterijomis reguliatorius. Bakterijos, pasižyminčios stipriai indukuojama ACC deaminaze, gali būti augalų augimo skatintojos, nes jos mažina augalų stresą, sukeltą per didelio etileno kiekio, taigi tai gali būti tarpusavio prisitaikymo atvejis.
Etileno biosintezė griežtai reguliuojama transkripcijos metu ir po jos. Reguliuojantys veiksniai priklauso nuo įvairių aplinkos signalų įskaitant biotinį (pavyzdžiui, patogenų infekciją) ir abiotinį (sukeliantis pažeidimus ozonas ir UV-B šviesa) stresą.
Etileno biosintezės kelyje, S-adenozilmetioninas (S-AdoMet) yra 1-aminociklopropano-1-karboksilato sintazės (ASC) paverčiamas į 1-aminociklopropano-1- karboksilatą (ACC) – etileno pirmtaką. ASC baltymai ypatingai svarbūs etileno biosintezėje. Esant ACC diaminazę gaminančių bakterijų, augalo ACC yra degraduojamas bakterijų ląstelių joms apsirūpinant aprūpinant azotu ir energija. Pašalinant ACC, bakterijos sumažina žalingą etileno poveikį, taip nuslopindamos augalo stresą ir skatina augimą.
Bakterijos, išskiriančios hormonus, tokius kaip indolil-3-acto rūgštis (IAR), giberelinus ir citokininus, gali įtakoti augalo augimą ir vystymąsi. Fitohormonas toks kaip IAR, dalyvauja kaip signalinė molekulė bakterijų komunikacijoje. Negana to, skirtingi IAR biosintezės keliai gali įtakoti skirtingus augalų ir bakterijų santykius. Augalui naudingos bakterijos gamina IAR per indolil-3-piruvato (IpyA) kelią, tuo tarpu patogeniška bakterija pagrinde sintetina IAR per indolil-3-acetamido (IAM) kelią. Augalo ir mikrobų sąveikoje yra svarbus ir gaminamos IAR kiekis. Augalo IAR geba indukuoti vieno iš ACC sintazės genų šeimos ACS4 transkripciją, tai rodo, kad IAR ir etileno reguliacija susijusi (Hardoim ir kt., 2008).
Azoto fiksavimas yra plačiai paplitęs tarp eubakterijų ir archėjų. Visos šios bakterijos turi fermento nitrogenazės kompleksą, kuris yra atsakingas už azoto dujų redukciją į amoniaką. Azoto fiksavimo genai (nif) buvo nustatyti ir ištirti daugelyje bakterijų rūšių. Labiausiai ištirtos yra Klebsiella pneumoniae (oxytoca) ir Azotobacter vinelandii. Labai mažai informacijos yra apie nif genus c – proteobakterijose, išskyrus Pantoe agglomerans padermę. Ilgai buvo manoma, kad Pseudomonas sensu stricto padermių atstovai negali fiksuoti azoto. Galimi Pseudomonas azoto fiksatoriai buvo priskirti a- ir b- protebakterijoms (Desnoues ir kt., 2003).

1. 1. 2. Mikroorganizmų tarpusavio sąveikos

Tarpusavio mikroorganizmų sąveikos gali būti naudingos patogenų biologinei kontrolei. Pavyzdžiui, kai kurios bakterijų savybės susijusios su patogeneze, arba patogenų slopinimu, pasireiškia tik tada, kai populiacijos tankis pasiekia tam tikrą lygį – kvorumą. Tai yra kaip atsakas į bakterijų signalines molekules, tokias kaip N-acil-homoserino laktonas (AHL) gramneigiamose bakterijose, ir mažus peptidus gramteigiamose bakterijose. Kitos populiacijos bakterijos gali šias signalines molekules perimti, suskaidyti, arba pagaminti panašias signalines molekules, ir taip pakeisti nuo šių signalų priklausomą informacijos perdavimą tarp pirmos populiacijos ląstelių. Pavyzdžiui, Pseudomonas aureofaciens gamina fenazes kaip atsaką į kitų bakterijų AHL išskyrimą. Tarp AHL išskiriančių bakterijų yra ir jautrių fenazėms, kurios žūsta. AHL slopinimas gali susilpninti šį junginį turinčių patogenų savybes, kaip tai buvo nustatyta tiriant Erwinia carotovora ir Agrobacterium tumefaciens (Beattie, 2006).

1. 1. 3. Augalo atsakas į mikroorganizmų pažeidimą

Tiek filoplane, tiek ir kitose augalo dalyse, priklausomai nuo augalo rūšies, yra kaupiami antriniai metabolitai. Lapą paveikus mechaniškai, jie yra išskiriami pro pažeistas vietas. Daugumą augalų sudaro kelių tipų antriniai metabolitai: pigmentai, alkaloidai, terpenoidai, flavonoidai, keli kiti polifenoliniai ir su jais susiję junginiai. Tam tikri augalai lapo paviršiuje turi liaukas, arba liaukines trichomas, per kurias gali būti išskiriami aliejiniai lašai, arba sirupai, į kurių sudėtį įeina terpenoidai, cukrūs, cukraus esteriai, riebiosios rūgštys ir kiti antriniai metabolitai.

Antriniai metabolitai siejami su fitopatogeniškų bakterijų ir augalų sąveikomis. Pavyzdžiui, Pachira aquatica (liet. Vandeninė raivė) kaupia seskviterpeno kvinono aldehidą isohemigossypolone. Kada Pseudomonas syringae patenka į pažeistus augalo audinius, P. aquatica pradeda gaminti ir kaupti šį antimikrobinį junginį. Bakterijos, kurios yra veikiamos šio junginio, geba jį detoksikuoti visiškai redukuodamos formilo grupę. Tačiau augalas vistiek kaupia deformuotus isohemigossypolone junginius ir vis dar rodo žymų antimikrobinį aktyvumą.
Panašu, kad kai kurie mikroorganizmai ir augalai sudaro sinergizmą bei simbiozę panaudodami chemines medžiagas, kurios yra kaupiamos įvairiose augalo dalyse (Hashidoko,
2005).

1. 2. Filosfera ir epifitiniai mikroorganizmai

Augalai yra puiki buveinė mikrobams plisti, daugintis bei išgyventi. Dažniausiai mikroorganizmai plinta drėgnose bei turtingose maistinėmis medžiagomis augalo dalyse, nors geba prisitaikyti ir prie skurdžios, stresinės aplinkos. Daugiausiai mikroorganizmų aptinkama ant sėklų, šaknų, lapų ir vaisių paviršių, tuo tarpu žieduose, stiebuose, indų audiniuose ir tarpląstelinėse vidinėse augalo dalyse jų arba nėra, arba aptinkama labai mažai.
Filosfera vadinamos išorinės, viršžeminės augalo dalys, tokios kaip lapai, stiebai, žiedai ir vaisiai. Skirtingai nuo rizosferos (šaknų ir dirvožemio aplinkos), filosfera yra veikiama didelės ir sparčios temperatūrų kaitos, saulės, vandens prieinamumo (pastarasis priklauso nuo lietaus, rasos, rūko ir mažėja nuo vėjo). Lapo paviršiuje aptinkama vidutiniškai mažiau nei 10 bakt./ g lapo. Sis kiekis priklauso nuo augalo rūšies, fiziologijos, amžiaus bei aplinkos sąlygų. Žiedai ir vaisiai laikomi unikaliomis buveinėmis. Nors žiedų gyvavimo laikas trumpas, bet jie sudaro cukrumi turtingą nektarą (10 – 50% sacharozės) ir yra patrauklūs vabzdžiams, kurie perneša bakterijas. Vaisių epidermį gaubia plona kutikulė, kuri sumažina vandens ir maistinių medžiagų pratekėjimą ant vaisiaus paviršiaus (Beattie, 2006).
Cheminiai ir fiziniai veiksniai riboja bakterijų augimą ir išlikimą filosferoje. Galima manyti, kad bakterijos turėtų būti specifinio fenotipo, kuris leistų apeiti šiuos apribojimus. Tokio fenotipo atstovai gali pasižymėti savybėmis, padedančiomis padidinti maistinių medžiagų prieinamumą filoplane. Pavyzdžiui, bakterijos gali paskatinti lapo ar spyglio drėkinimą pasitelkiant junginius, kurie keičia paviršines savybes. Nustatyta, kad šį gebėjimą turi 50% Pseudomonas genčių. Bakterijų judėjimui įtakos turi ir biologinis paviršius, kuriame aptinkamas toksinas tolaasi, kurį išskiria Pseudomonas tolaasi. Paviršine vandens plėvele per visą spyglio paviršių gali plisti bakterijos į tas sritis, kuriose yra gausūs maistinių medžiagų ištekliai. Taigi, biologinių paviršių gamyba gali būti vienas iš bruožų, pagal kurį bakterijos gali keisti buveinę ar naudoti ją efektyviau.
14
Didelis kiekis UV spinduliuotės yra aplinkos sąlyga, prie kurios epifitai turėjo prisitaikyti. Didelė epifitinių bakterijų pigmentacija laikoma apsauga nuo UV spindulių. Įdomu tai, kad atspariausios UV spinduliams yra bakterijos turinčios rausvo ar oranžinio pigmento. Epifitinių bakterijų Pseudomonas syringae UV tolerancija yra susijusi UV indukuojamais plazmidės rulAB genais, kurie taiso DNR mutacijas. Beveik visos natūraliai paplitusios rūšys turi rulAB lokusą ir tos, kurios neturi šio lokuso, mažiau toleruoja UV spindulius. Šių prisitaikymui svarbių genų lokalizacija plazmidėse leidžia jiems išlikti populiacijoje. Epifitų P. syringae DNR pažaidų reparacija sudaro sąlygas adaptyviai genomo evoliucijai, kadangi ląstelėms periodiškai patiriant UV poveikį, mutacijų dažnis laikinai padidėja (Lindow, Brandl, 2003). Nepigmentuoti tipai dažnai turi aukštus GC kiekį savo genominėje DNR. Dėl to kad UV spinduliavimo sukelta timino dimerizacija sukelia mutacijas, didelis GC kiekis (mažas santykinis timino kiekis) gali būti iš dalies apsaugoti nuo letalaus UV spinduliavimo efekto saulėkaitoje (Gnanamanickam, Ebenezar Immanuel 2006).
Yra du būdai patikrinti mikroorganizmų buvimą ant spyglio paviršiaus. Pirmasis -plovimas, kuris padeda nustatyti ląstelių skaičių, heterotrofinius organizmus, bakterijas, grybelius, amonio ir nitratų oksidatorius. Antrasis – paremtas molekulinės biologijos metodais -mikroorganizmų augančių lapų paviršiuje DNR analize. Vykdoma PGR, naudojant pradmenis prokariotams (pagal 16S – 23S rDNR).
Kyla klausimas, ką reiktų vadinti epifitinėmis bakterijomis. Didžioji dalis bakterijų kolonijų yra lengvai nuplaunamos nuo spyglių paviršiaus arba nužudomos peroksidu, UV spinduliais ar kt. Tikrosios sąlygos tikriausiai skiriasi nuo atliktų švitinimo, drėgmės ir kitų matavimų. Tyrimai naudojant fluorescuojančio reporterinio baltymo geną su promotoriumi reaguojančiu į vandens kiekį, parodė, kad didelis kiekis Pantoea agglomerans ląstelių nepatyrė didelio vandens streso, kaip buvo galima tikėtis, taip parodydami, kad filosfera iš tikro šiek tiek sušvelnina neigiamus atmosferos sąlygų padarinius.
Didelio dėmesio reikalauja ir įvairios epifitinių bakterijų sąveikos ir santykiai su augalais. Taip pat aktuali sąveika tarp pačių bakterijų.
Natūralūs miškai yra kompleksinė buveinė, gausi organizmais ir sąveikomis tarp jų. Antžeminių augalų paviršius yra užimtas įvairių mikrofloros grupių, kurios yra apibrėžiamos kaip epifitų mikroflora. Šioje aplinkoje epifitai yra kaip laikini gyventojai, kurie nusėda ant spyglių paviršiaus dėl kritulių, arba vėjo ir vabzdžių pagalba.
Epifitinės mikrofloros vaidmuo nėra visiškai išaiškintas. Žinoma, kad ši grupė apima augalų patogenus ir mikroflorą, kuri aprūpina apsauginiu barjeru prieš juos. Šios mikrofloros turi įtakos augalo sveikatai, veikia ekosistemų ir agrokultūrų funkcijas. Aptikta, kad kelios bakterijų rūšys sintetina augalo hormonus bei veikia augalo augimą. Vis dėlto nustatyta ir žalingų augalams mikroorganizmų rūšių.
Spyglio paviršiaus mikroflora kinta dėl biotinių ir abiotinių veiksnių, kurie įtakoja jos augimą ir išgyvenamumą. Tai spyglių amžius, išorinės maistingosios medžiagos, skirtingų organizmų populiacijų sąveikos, temperatūra, drėgmė, šviesos intensyvumas, vėjo greitis, oro užterštumas ir kt.
Alamri atliko filosferos ir epifitinių mikroorganizmų tyrimus. Jis teigė, kad Afrikinio kadagio (Juniperus procera) mikroflorą sudaro bakterijos, aktinomicetai, mielės ir filamentiniai grybai, kurie yra priklausomi nuo aukštumų, kuriose augalas auga, bei sezono. Gausesnė mikroflora paprastai būna senesniuose lapuose, nei jaunuose. Žemesnių aukštumų mikroflora yra įvairesnė, palyginus su aukštomis.
Juniperus procera medžiai per pastarąjį dešimtmetį jiems įprastoje buveinėje, vakarinėje Saudo Arabijoje, nyksta. Atliktas tyrimas padėjo nustatyti kelias priežastis, dėl kurių šie medžiai nyko. Tam buvo reikalinga apibrėžti mikrofloros sudėtines dalis Juniperus procera spygliuose, susiejant su spyglio amžiumi, surinkimo laiku ir skirtinga aukštuma.
Rezultatai parodė, kad senesniuose spygliuose buvo aptikta daugiau bakterinių mikroorganizmų, negu jaunuose. Išskirta apie 200 mikroorganizmų kultūrų. Pagrindinės yra Pseudomonas, geltonos pigmentuotos lazdelės, nepigmentuotos lazdelės, streptokokai, sporas sudarančios lazdelės, aktinomicetai.
Šio tyrimo rezultatai leidžia teigti, kad mikroflora užima didžiąją dalį antžeminių augalų.
2 5 7 ^
Ištirta, kad 1 – ame cm lapo ploto gali būti apie 10 – 10 bakterinių ląstelių. Šios vertės gali būti išreikštos viename grame grynos ir sausos lapų masės. Tada viename grame grynos spyglių masės
5 — 8
gali būti 10 10 bakterinių ląstelių. Epifitinei mikroflorai įtakos turi spyglių subrendimas ir pozicija (Alamri, 2008).
Ligų paplitimas lėmė patogeniškų epifitinių bakterijų tyrimus. Ištyrus santykį tarp lapijos ligų ir populiacijos tankio, buvo nustatyta, kad bakterijų populiacijos dydis įtakoja ligos pradžią. Žinoma, kad ligos sukėlimą pirmiausia lemia šeimininko genotipas, o tik po to aplinkos veiksniai. Kada bakterijų populiacija pasiekia slenkstinį dydį, ir jei augalas yra imlus virulentiškams patogenams, liga pradeda plisti.
Bakterijų patogenai geba kolonizuoti sveikų augalų lapų paviršius. Pirmiausia tai buvo aprašyta Crosse (1959) išskyrus didelius kiekius Pseudomonas syringae pv. morsprunorum (skatinanti vaismedžių kauliukų vėžį padermė) nuo sveikų vyšnios lapų. English ir Davis (1960) taip pat išskyrė P. syringae nuo sveikų persikų ir migdolo lapų. Šie atradimai davė pradžią tolimesniems Leben (1963, 1965) darbams, kuriais buvo apibrėžta, kad fitopatogeniškos bakterijos turi laikiną, arba epifitinę, augimo fazę ant sveikų augalo audinių. Leben pasiūlė, kad augalų patogeniškos bakterijos būtų inokuliuojamos sveiko augalo paviršiuje dar nesant ligai, ir tokiu būdu nuo jos apsisaugoti. Tokie patogenai gali turėti laikiną arba patogenišką augimo fazę. Si hipotezė pateikė naujas įžvalgas apie augalų lapijos patogeniškų bakterijų epidemiologiją.
Hirano ir Upper (1983) sudarė sąrašą tokių patogeniškų bakterijų, kurios yra žinomos, arba tikimąsi turinčios potencialą, epifitiškai augti ant augalo paviršiaus. Sis sąrašas buvo papildytas Erwinia, Pseudomonas ir Xanthomonas gentimis, kurios įtakojo augalus globaliai (Gnanamanickam, Ebenezar Immanuel, 2006).

1. 3. Netiesioginis augalų augimo skatinimas

Mikroorganizmų įtaka augalo augimui ir sėklų sudygimui yra daugiau naudinga, nei žalinga. Svarbiausi augalų augimo skatinimo mechanizmai yra tiesioginis fitohormonų veikimas, indukuotas (angl. ISR) ir įgytas (angl. SAR) augalo atsparumas ligoms, maistinių medžiagų prieinamumas ir kitų augalui naudingų mikroorganizmų padidėjimas (Jeon ir kt., 2003).
Biologiškai aktyvių junginių išskyrimas remiasi keletu veiksnių. Tai tinkamų mikroorganizmų atrinkimas, išskyrimas ir kultūrinimo metodų pritaikymas, taip pat išskirtų metabolitų detekcija ir identifikacija. Antriniai metabolitai svarbūs tiriant bioheminius procesus. Dabartiniai cheminiai tyrimų metodai buvo išvystyti išskiriant aktyvius metabolitus iš ekstraktų. Plonasluoksnė chromatografija ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodai yra naudojami įvairių tipų biologinių molekulių ir antrinių metabolitų detekcijai, atskyrimui ir gryninimui (Muzzamal ir kt., 2012).

1. 3. 1. Augalo gynybinė sistema

Mikroorganizmai veikia augalą per indukuotą sistemos atsparumą (ISR) ir/ arba sistemos įgytą atsparumą (SAR), išskirdami antigrybelinius metabolitus (AFM), arba paviršiuje aktyvius ciklinius lipopeptidus, kurie kontroliuoja augalų patogenų, plintančių iš dirvožemio, augimą. ISR susijęs su sideroforų išskyrimu, taip pat jam būdingi lipopolisacharidų ir salicilatų O – antigenai. Dažnai ISR ir SAR yra aktyvuojami tuo pat metu, nors abu procesai yra nepriklausomi (Ping,
Boland, 2004).
Augalo gynybinė sistema yra sudaryta iš didelio kiekio skirtingų fermentų, iš kurių pagrindinis yra chitinazė. Sis fermentas yra ypatingai svarbus dėl to, kad jo substratai yra ne iš augalų, bet iš grybelinių ląstelių sienelių, kurių dauguma yra patogeniškos.
Chitinas yra vienas iš gausiausių biopolimerų (kaip ir celiuliozė) ir aptinkamas grybų ląstelės sienelėje ir daugelio organizmų egzoskelete, įskaitant parazitus helmintus ir nariuotakojus.
Grybinės ląstelės sienelės sienelė yra sudaryta iš membranos, kurią sudaro skirtingi membraniniai baltymai, apsauginio chitino sluoksnio, gliukanų (daugiausia P), bei paviršiniai baltymų. Grybų ląstelės gali skirtis gliukanais. Pavyzdžiui, A. fumigatus sudaro P – 1, 3 ir P – 1, 4 -gliukanas, tuo tarpu C. albicans sudaro P-1, 3 ir P-1, 6-gliukanas (Vega, Kalkum, 2012).
Mikroorganizmai, gebantys lizuoti chitiną, linijinį P-1, 4-N-acetilgliukozamino polisacharidą, yra svarbūs biologinėje kontrolėje prieš grybelinius patogenus.
Chitinazė yra svarbus fermentas, kuris katalizuoja netirpų chitiną į monomerinius ar oligomerinius komponentus. Tyrimuose svarbus yra šį fermentą koduojančio geno nustatymas.
Usharani ir Gowda (2010) publikavo tyrimus, atliktus su Bacillus thuringiensis. Konstrukcinės plazmidės pHya2 ir pHYB43 pasižymėjo aukštu chitinazės aktyvumu. Skirtingos B. thuringiensis gebėjo slopinti skirtingas grybelines padermes. Pavyzdžiui, B. thuringiensis padermės 50E ir 48F slopino F. Oxysporum. Kitos tirtos B. thuringiensis padermės pasižymėjo B. bassiana, S. rolfsii, A. flavus slopinimu (Usharani, Gowda, 2010).
Bakterijos gamina chitinazes tam, kad degraduotų chitiną ir utilizuotų jį kaip energijos šaltinį. Kai kurios chitinazės iš jas gaminačių bakterijų, tokios kaip chiA geną turinčios Serratia marcescens ir Enterobacter agglomerans gali būti panaudojamos prieš augalą pažeidžiančius grybelinius fitopatogenus. Vėliau fermentai slopina grybelio augimą hidrolizuodami chitino buvimą ląstelės sienelėje.
Kamil ir kt. (2007) publikavo straipsnį, kuriame aprašo iš Egipto žemės išskirtų mikroorganizmų gebėjimą išskirti fermentą chitinazę, ir taip slopinti grybelinius patogenus. Nustatytos šios chitinazę išskiriančių mikroorganizmų rūšys: Bacillus licheniformis, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus thuringiensis. Visi šie organizmai gebėjo slopinti grybelinių padermių Rhizoctonia solani, Macrophomina phasidina, Fusarium culmorum, Pythium sp., Alternaria alternata ir Sclerotium rolfsii augimą. B. licheniformis pasižymėjo didžiausiu chitinazės aktyvumu (1, 27 U/ ml, po 96 h) (Kamil ir kt., 2007).
Filosferos epifitai geba reaguoti į besikeičiančias aplinkos sąlygas, ir, esant joms nepalankioms, patirti stresą.
Prisitaikyti prie streso padeda baltymai, kurie yra specifiniai kiekvienai bakterijų rūšiai. Tai superoksido dismutazė, katalazės, DNR apsauginiai baltymai ir baltymai, dalyvaujantys osmoprotektanto trehalozės gamyboje. Methylobacterium, Alphaproteobacteria bendro streso atsako sistemą sudaro dvikomponentė PhyR – EcfG reguliavimo sistema. PhyR ir EcfG buvo aptikti tiriant Methylobacterium, Sphingomonas ir Auratimonas genties bakterijų baltymus.
Baltymai, pavyzdžiui, hidroperoksido reduktazė, DNR apsaugos baltymai, katalazės ir serino proteazės MucD yra susiję su gammaproteobakterijų streso atsaku. Žinomas oksidacinio streso reguliatorius yra OxyR baltymas. AlgD baltymai, kurie taip pat atlieka vaidmenį patirto streso reguliavime, dalyvauja egzopolisacharido alginato biosintezėje. Tai svarbu padidėjusiam epifitų sveikatingumui, virulentiškumui, apsaugai nuo išdžiūvimo ir toksinių medžiagų. Padidintas su atsaku į stresą susijusių baltymų kiekis buvo aptiktas sojos mėginiuose. Tai gali būti dėl augalo gynybinio atsako, kurį sukėlė pseudomono flagelinas. Pseudomonas turi daug flagelinų palyginus su kitomis bakterijomis. Sojos augaluose taip pat aptikta P. syringae pv. glycinae susijusių su patogenais (Delmotte ir kt., 2009).
Toksino sirigomicino biosintezės genai ir sekrecija buvo aptikti daugelyje P. syringae pv. syringae, įskaitant ir nepatogenines rūšis, kurios paprastai aptinkamos kaip epifitai įvairiuose augaluose. Siringomicino gamyba yra svarbus virulentiškumo veiksnys P. syringae pv. syringae. Šis toksinas veikia jonų transportą per augalų ląstelių plazmines membranas suformuodamas jonų kanalus; jonų srautas sukelia metabolitų išsiskyrimą iš augalų ląstelių ir ląstelių lizę. Pastebimas porų susidarymo aktyvumo lygis augalų ląstelėse buvo aptiktas esant daug žemesnėms, negu reikia ląstelių lizei, siringomicino koncentracijoms. Nepatogeninės P. syringae gentys gali sintezuoti tokį kiekį siringomicino, kuris yra per mažas sukelti ląstelių nekrozę ar ligą, bet pakankamai didelis sukelti nedidelį augalų metabolitų išskyrimą; be to, jis veikia kaip potenciali biologinio paviršiaus medžiaga. Šios savybės gali paaiškinti, kodėl siringomicino produktai, biosintezės kompleksas ir proceso reguliatorius, buvo aptikti patogeninėse ir nepatogeninėse P. syringae gentyse (Lindow,
Brandl, 2003).

1. 3. 2. Augalų augimą skatinančių bakterijų išskiriami lakūs junginiai

Yra metodų, skirtų dujinėje fazėje identifikuoti lakius junginius, kuriais augalai keičiasi tarpusavyje arba su kitais organizmais. Dujinis etilenas, fitohormonų rūgštys, lakus salicilo rūgšties metilo esteris, neprisotinti aldehidai ir terpenoidai veikia augalų genų ekspresiją.
Du labiausiai paplitę kultūrų Bacillus subtilis ir Bacillus amyloliquefaciens išskirti junginiai identifikuoti kaip 3-hidrobutano-2-ono (acetoinas) ir 2, 3-butandiolis (2, 3-B). Kiti B. subtilis junginių kompleksai, pavyzdžiui, dekanas, undekanas, undekanas-2-onas, tridekanas-2-onas ir tridekanas-2-olis, nėra aktyvūs. Acetoinas ir 2, 3-B priklausomai nuo dozės geba stimuliuoti augalų augimą. Optimali 2, 3 — B (gauto iš abiejų Bacillus sp. padermių) koncentracija yra nuo 1 iki 100 ug. Mutantinėse B. subtilis padermėse su genetiškai blokuota 2, 3 — B gamyba augimo skatinimas nevyksta, taigi šis junginys susijęs su augimo skatinimu.
Be augimo skatinimo, lakieji junginiai gali atlikti ir ISR sužadinimo funkciją. Atlikto tyrimo metu, užteko paveikti Arabidopsis sodinukus 4 dienas lakiais Bacillus sp. junginiais, kad aktyvuotųsi ISR. Tai buvo parodyta, užkrėtus patogenu Erwinia carotovora, kai po 24h trukusios inokuliacijos buvo žymiai mažiau pažeistų lapų (Ping, Boland).

Biologinė kontrolė vadinamas patogenus slopinančių mikroorganizmų panaudojimas, siekiant išlaikyti augalą sveiką. Tai yra puiki alternatyva cheminiams fungicidams, kurie teršia aplinką ir maistinius pasėlius. Biokontrolė yra saugus, ekologiškas ir ilgalaikis procesas. Puikiai biokontrolei yra tinkami saprofitiniai mikroorganizmai, gebantys nuslopinti augalų patogenus. Pavyzdžiui, Pseudomonas gamina antrinius metabolitus, tokius kaip antibiotinės medžiagos ar sideroforai, taip pat konkuruoja su patogenais dėl maistinių medžiagų. Pseudomonas gamina tokius antibiotikus kaip, fenazinas, pirolnitrinas, oomicinas A, geldanamicinas, pioluteorinas, piocianinas

ir 2-4 diacetilflorogliucinolis. Pseudomonas taip pat išskiria organinius lakiuosius junginius, kurie veikia antigrybiškai prieš Phytophthora vignae in vitro sąlygomis (Dilantha Fernando ir kt., 2005). Žinoma, kad antigrybiniai junginiai yra būdingi ir Streptomyces ir Bacillus mikroorganizmų rūšims. Nustatyta, kad antimikrobinių junginių susidarymą įtakoja mikroorganizmų populiacijų ryšiai tiek transgeniniuose, tiek natūraliuose augaluose. Tai atspindi sudėtingą padermės elgesį bendruomenėje lyginant su gryna kultūra. Chitinazės, gliukanazės, celiulazės, lipazės ir kiti lizuojantys fermentai taip pat efektyviai veikia biologinėje kontrolėje (Beattie, 2006).

1. 3. 4. Mikrooganizmų išskiriami antigrybiniai lakūs junginiai

Išskiriamų organinių lakiųjų junginių panaudojimas prieš grybelinius patogenus dar nėra plačiai taikomas. Dilatha Fernando ir kt. (2005) publikavo savo atliktų tyrimų duomenis. Tyrimo objektu buvo pasirinktas plačiai paplitęs Sclerotinia sclerotiorum (Lib.). Šis patogenas sukelia ligas net 400 augalų rūšių. Nė vienas iš šių augalų neturi genetinio atsparumo patogenams, todėl buvo taikyta biologinė kontrolė.
Bakterijos, išskirtos iš rapsų ir ražienų, bei sojos šaknų, gamina lakiuosius junginius, kurie slopina S. sclerotiorum infekciją. Nustatyta, kad lakiųjų junginių gamyba yra priklausoma nuo kokios augalo dalies buvo išskirti mikroorganizmai. Vidutiniškai ir daugiausiai junginių išskyrė bakterijos išskirtos iš dirvožemio, bei iš su dirvožemiu susijusių augalo dalių. Tačiau, oksalato oksidazę gaminančios bakterijos, pavyzdžiui, Pantoe agglomerans buvo iškirtos iš rapsų lapų bei žiedų. Jeigu oksalo rūgštis, S. sclerotiorum patogeniškumo požymis, gali būti degraduojama oksalato oksidazės, bakterijos gebančios išskirti šį fermentą turėtų būti efektyviausios ant lapų ir žiedų. Lakiuosius junginius išskiriančios Pseudomonas bakterijos paplitusios dirvožemyje, tuo tarpu Pantoe agglomerans yra priskiriamos filosferos mikroroganizmams.
Fiddaman ir Rossall (1994) nustatė, kad lakiųjų junginių gamyba ir antigrybelinė jų funkcija yra priklausomi nuo azoto ir anglies procesai.
Neorganiniai lakieji junginiai, tokie kaip amoniakas, gaminamas Enterobacter cloacae, atrodo yra tik vienas iš daugelio mechanizmų naudojamas biokontrolėje prieš Pythium spp. Lakiųjų junginių antigrybinės savybės yra specifiškos ir priklausomos nuo rūšies bei aplinkos. Alilinis alkoholis slopina S. sclerotiorum, bet tuo pačiu metu skatina skleročių kolonizaciją sukeltą Trichoderma spp. Alilo alkoholis taip pat mažina naudingųjų bakterijų, tokių kaip P. fluorescens ir P. putida, populiacijas.
Cheminė organinių lakiųjų junginių prigimtis yra jų antigrybinis aktyvumas. Dilantha Fernando ir kt. (2005) nustatė, kad iš šešių tirtų lakiųjų junginių, kurie pasižymėjo aukštu fungicidiškumu, du buvo aldehidai (nonalis ir n – dekanalis), ir du alkoholiai (cikloheksanolis ir 2¬21 etil, 1-heksanolis), bei du sieriniai junginiai (benzotiazolis ir dimetiltrisulfidas). Komercinių fungicidų ir kitų dirvožemio mikroorganizmus naikinačių medžiagų sudėtyje taip pat yra sieros. Nonalio ir dekanalio antigrybinės savybės jau buvo nustatytos anksčiau. Šios dvi medžiagos yra pagrindinės Hibiscus cannabinus esensinio aliejaus sudedamosios dalys, atsakingos už antigrybiškumą prieš tris Collelotrichum rūšis. Nonalis, gaminamas medvilnės lapuose, yra atsakingas už Aspergillus flavus ir A. parasiticus išskirtų aflatoksinų mažinimą. Fernando ir kt. (2005) nurodo, kad P. aurantiaca ir P. chlororaphis (biotipas D) gebėjo slopinti sklerotį dirvožemyje, nes gamino nanonalį, o P. chlororaphis (biotipas D) dar ir dekanalį. a, P —nesočiųjų ryšių buvimas šalia karbonilinių dalių padaro molekules reaktyvesnes ir padidina antigrybinį aktyvumą. Dėl to 2 — nonenalis ir 2- heksanalis yra labiau antigrybiški, nei nonalis. Šie junginiai, ypatingai 2 — heksanalis, sudaro didžiąją dalį tarp augalo lakiųjų junginių, išskirtų jį pažeidus, ir gali būti susijęs su augalo gynybine sistema. Spėjama, kad 2-heksanalis gali slopinti dirvožemio patogenus S. sclerotium, Phytophthora spp., Pythium spp.
Bakteriniai lakūs junginiai taip pat skatina augalų augimą. 2, 3-butandiolis skatino Arabidopsis thaliana augimą ir slopino patogeną Erwinia carotovora. Slopinančių lakiųjų junginių gamyba gali padidinti dirvožemio bakterijų išgyvenamumą, nes taip pašalinami potencialūs konkurentai dėl maistinių medžiagų (Dilantha Fernando ir kt., 2005).

1. 3. 5. Mikroorganizmų išskiriami antigrybiniai antriniai metabolitai

Hashidoko (2005) publikavo duomenis dviejų y — proteobakterijų bakterijų, išskirtų iš Rahnella aquatilis jaunų ir subrendusių lapų. Šios dvi padermės parodė ženklų gebėjimą dekarboksiluoti polihidroksibenzoines rugštis, įskaitant ir gallic rūgštį, ir 3, 4-dihidrobenzoinę rūgštį, veikiant galato dekarboksilazei (GD). GD aktyvumas yra indukuojamas substratų, o dekarboksilinimo produktai pasižymi stipriu antimikrobiniu aktyvumu.
Kai kurios bakterijos, išskirtos iš chlorogeninių rūgščių turinčių pažeistų augalų lapų, gali dekarboksilinti 4-hidroksilines E-cinamines rūgštis, dalinius vienetus cinamilinės quinic rūgštis, panaudojant 4-hidroksicinamato dekarboksilaze (4-HCD). Šis junginys aptinkamas ant lapų paviršiaus paplitusiame epifite Klebsiella oxytoca. Hashidoko (2005) atliko tyrimą, kurio metu 4-HCD sudarančios bulvių dekstrozės agaro lėkštelėse, buvo inokuliuojamas laukinis K. oxytoca statmenai prieš tai inokuliavus Fusarium solani. Tai parodė aiškų augimo slopinimą tuose vietose, kur bakterijos ir grybinės kolonijos buvo inokuliuotos, dėl terpėje esančio 4-hidroksicinaminės rūgšties.
Dekarboksilinimo produktai, 4-hidroksistirenai, slopina eukariotinių Fusarium solani ir Rhizoctonia solani organizmų augimą, bet nėra toksiški bakterijoms. Galima teigti, kad kai kurios filoplano bakterijos geba sparčiai detoksifikuoti antrinius metabolitus, kuriuos išskiria pažeisti lapai. Taip pat šio bakterijos geba panaudoti tokius detoksikuotus metabolitus kaip chemines medžiagas savo pačių mikrofloros reguliavimui. Kai kurie lapų epifitai stabilizuoja filosferos mikroflorą ir funkcijas, bei pasirūpina pažeistomis augalo dalimis, kad per jas nepatektų fitopatogeniški mikroorganizmai (Hashidoko, 2005).
Vandenilio cianidas yra antrinis metabolitas, kuris negatyviai veikia šaknų audinio metabolizmą ir augimą. Šis junginys plačiai paplitęs tarp Pseudomonas. Ypač daug jo aptinkama P. fluorescens padermėse (Rust ir kt., 1980).
Pseudomonas aeruginosa yra vienas iš organizmų, gebančių sintetinti cianidą. Ši sintezė yra priklausoma nuo glicino oksidacinio dekarboksilinimo, kurį atlieka vandenilio cianido sintezės fermentas. Šio proceso metu gaunami 4 elektronai ir 4 vandenilio jonai vienai glicino molekulei. P. aeruginosa cianido sintezė priklausoma nuo žemesnių mikroaerobinių sąlygų (O2, 5%), bet ji yra neaktyvi tiek atmosferos deguonies, tiek anaerobinėse sąlygose. Efektyviausiai cianido gamyba vyksta 340C – 370C temperatūrose. Cianido koncentracija skystyje ar kietoje fazėje gali būti matuojama cianido elektrodu. Dujinės fazės vandenilio cianido koncentracija gali būti matuojama masės spektrometru (Lenney, Gilchrist, 2011).
Rust ir kt. (1980) tyrimo metu nustatė, kad nebuvo žymaus skirtumo tarp bakterijų išskiriamo vandenilio cianido kiekio priklausomai nuo augalo rūšies. Tačiau grybeliniai patogenai, išskirti iš cianogeninių augalų, buvo tolerantiškesni vandenilio cianidui. Pavyzdžiui, patogenas Xanthomonas manihotis, išskirtas iš cianogeninio augalo, buvo atsparesnis vandenilio cianidui, nei kitos patogeniškos rūšys (Rust ir kt., 1980).

1. 3. 6. Fluorescuojančių Pseudomonas padermių reikšmė biokontrolei

Fluorescuojančios Pseudomonas spp. nuo kitų bakterijų skiriasi savo gebėjimu išskirti vandenyje tirpų geltonai žalią pigmentą. Tai yra tipinė gramneigiama chemoheterotrofinė judanti lazdelė su poliniais žiuželiais, ir priskiriama I-ai grupei pagal rRNR homologiją (pagal Palleroni ir kt.) Pagal klasifikaciją visos Pseudomonas spp. skirstomos į penkias grupes pagal rRNR genus, kurie, lyginant su kitomis DNR sekomis, mažiau kinta evoliucijos eigoje. Fluorescuojančioms Pseudomonas bakterijos nereiklios maisto šaltiniams, tai atspindi gausus šių organizmų paplitimas gamtoje. Ši Pseudomonas rūšis aptinkama dirvožemyje, lapuose, vandenyje, nuosėdose, jūros vandenyse.
Nepaisant to, kad kelios fluorescuojančios Pseudomonas rūšys, pvz, Pseudomonas syrigae, priskiriamos prie patogeniškų augalams, kitos tos pačios grupės rūšys gali būti naudingos. Žinoma, kad Pseudomonas spp. geba skatinti augalų augimą. Taip pat šios bakterijos idealiai tinka dirvožemio tręšimui dėl plačios ir agresyvios kolonizacijos. Fluorescuojančios Pseudomonas gali būti taikomos augalo šaknų nuo žalingų mikroorganizmų apsaugai.
Specifinės fluorescuojančios Pseudomonas pasižymi Pythium grybelio slopinimu. Howell ir Stipanovic išskyrė fluorescuojančias Pseudomonas, kurios gali slopinti Pythium ultimum, žinomą medvilnės sodinukų patogeną. Si padermė 71 % padidino sodinukų išgyvenamumą Pythium ultimum užkrėstame dirvožemyje. Pythium rūšys taip pat žinomos kaip kviečių patogenai. Mažiausiai dešimt Pythium rūšių gali įtakoti kviečius infekuodamos embrionus ir sunaikinandamos šakniaplaukius bei šaknų užuomazgas. Weller ir Cook (1986) nurodė, kad fluorescuojančios Pseudomonas padermės gali padidinti kviečių derlių 26 % natūralioje Phytium rūšiai aplinkoje. Atlikus tyrimus su šia paderme šiltnamio sąlygomis, buvo gautas panašus padidėjimas kaip ir su komerciniu fungicidu metalaksilu.
Palyginus neseniai buvo išaiškinta visą antibiotikų įvairovė, kuriuos gamina skirtingi Pseudomonas kamienai. Fluorescuojančių Pseudomonas išskiria tokius junginius kaip fenazės, pioluteinas, pirolnitrinas, tropolinas, piocianinas ir 2,4-diacetilflorogliucinolis. Keli iš šių junginių, pavyzdžiui, tropolinas, pasižymi plačiu aktyvumu prieš daugelį bakterijų ir grybelių. Tokios plataus spektro antibiotinės medžiagos ne visada yra pageidaujamos dėl to, kad nuo jų žūsta ir daugelis naudingų organizmų. Kiti antibiotikai pasižymi skirtingu specifiškumu ir dėl to gali būti labiau selektyvūs prieš tam tikras mikrobų sukeltas ligas. Howell ir Stipanovic nustatė, kad pioluteorinas, išskirtas iš fluorescuojančių Pseudomonas, pasižymėjo apsauga prieš Pythium – sukeliantį medvilnės sodinukų išdžiūvimą. Tuo tarpu, pirolnitrinas, išskirtas iš kitų Pseudomonas, apsaugojo sodinukus nuo Rhizoctonia solani infekcijos.
Iš fluorescuojančių Pseudomonas padermių taip pat išskirtas antibiotikas 2,4-diacetilfloroglucinolis (DAPG). Genetiniais tyrimais įrodyta, kad šis junginys gali apsaugoti cukrinius runkelius nuo Pythium grybelio sukeliamos infekcijos – paveikus transpozonu TN5 gautas DAPG mutantas prarado savo gebėjimus. Tiriant dirvožemį, nustatyta, kad šis mutantas įtakojo sumažėjusį cukrinių runkelių sėklų sudygimą lyginant su izogenine pradine kultūra. Keel ir kt. (1990) nustatė tokius pat antibiotinius junginius, išskirtus fluorescuojančių Pseudomonas padermių, slopinančius juodąjį puvėsį tabake ir kviečiuose.
Nedaug yra žinoma apie fluorescuojančių Pseudomonas antibiotinių junginių reguliaciją. Vis dėl to, nustatyta, kad mažiausiai kelių antibiotikų gamyba yra įtakojama įvairių skirtingų fiziologinių sąlygų. James ir Gutterson nustatė, kad P. fluorescens padermės HV37a antibiotikų gamybai būtina gliukozė, tačiau ji slopino kitų kelių antibiotikų gamybą. Tokie cukrūs, kaip sacharozė, fruktozė, o taip pat manitolis, skatino gausų DAPG gaminimą, tuo tarpu gliukozė ir sorbozė – mažus kiekius. P. fluorescens padermės HV37a DAPG gamybą įtakoja ir temperatūra (120C).

Atlikti P. fluorescens HV37a papildomi tyrimai parodė, kad mažiausiai penki šios padermės genai koduoja grybelį slopinančias medžiagas. Plonasluoksnės chromatografijos metodu nustatyta, kad padermė HV37a išskiria mažiausiai tris antibiotikus. Vienas iš šių junginių -oomicinas A — slopina medvilnės šaknų Pythium infekciją (apie 70 % gebėjimo), bei apie 50 % padidina medvilnės sėklų sudygimą. Šių junginių gamyba skirtingai priklauso nuo gliukozės — vienam iš antibiotikų ji būtina, o kitus du ji slopina.
Kitas antibiotinis aktyvumas prieš Pythium ultimum buvo priklausomas nuo geležies. Nustatyta, kad šios padermės išskirti antibiotikai nebuvo biochemiškai ar genetiškai susiję su pseudobaktino sideroforais. Junginių, kurių gamyba nėra susijusi su geležies šaltiniu, bet yra reguliuojama geležimi, taip pat nustatyta Pseudomonas aeruginosa. Šie tyrimai leido daryti išvadą, kad geležis gali būti įvairių funkcijų, kurios būtinos augimui skurdžiose geležimi buveinėse pasireiškimui, reguliavimo signalas (O’Sullivan, OGara, 1992).
2. METODIKA

2. 1. Tiriamosios epifitinės bakterijų kultūros

Tiriamos epifitinių bakterijų kultūros buvo išskirtos nuo pušų spyglių, surinktų Kauno, Jonavos ir Radviliškio rajonuose, paviršiaus. Spygliai surinkti aseptiškai į sterilius plastikinius mėgintuvėlius. 3 – 5 spygliai buvo užpilti 1 ml sterilaus fiziologinio tirpalo (0, 9 % NaCl), intensyviai skalaujami, panaudojant purtyklę, ir inkubuojami kambario temperatūroje 30 min. Atitinkami išskirtų bakterijų skiedimai buvo išsėti į lėkšteles su agarizuota LB terpe ir inkubuojami termostate 250C.

2. 2. Epifitinių bakterijų antagonistinių sąveikų tyrimai

Darbo metu buvo tiriamas epifitinių bakterijų poveikis gramteigiamoms – Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, ir gramneigiamoms – Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium (SL 1344) kultūroms. Testinės kultūros buvo auginamos standžiose LB (Lennox) terpės Petri lėkštelėse ir skystose LB Broth (Lennox) (Carl Roth GmbH + Co) terpėse, 370C temperatūroje kaip naktinės kultūros.

IŠVADOS

1. Dalis tirtų epifitinės kilmės kultūrų pasižymėjo slopinančiu poveikiu laboratorinėms
testinėms kultūroms (M. luteus – 8, P. aeruginosa – 6, E.coli – 1). Tiriant bakterijų suspensijų
sterilius supernatantus, taip pat nustatytas slopinantis poveikis M. luteus (2 iš 15 – os), P.
aeruginosa (9 iš 15 -os) ir E. coli (2 iš 15 – os). Nustatyta, kad trys supernatantai gebėjo slopinti
daugiau nei vienos testinės kultūros augimą. Septynios epifitinės kultūros slopino testinių kultūrų
augimą atliekant tyrimus tiek su bakterine suspensija, tiek su steriliu supernatantu. Nė viena
epifitinė bakterija ir jos sekretuojamos medžiagos neslopino S. typhimurium (SL 1344), B. subtilis,
Staph. aureus augimo.
Nustatyta, kad tiriami epifitai pasižymi ir kita savybe – skatina testinių bakterijų augimą. Bakterinės suspensijos gebėjo skatinti M. luteus ( 8 iš 15 – os), S. typhimurium (5 iš 15 -os), Staph. aureus (6 iš 15 – os). Aštuoni bakterijų kultūrų supernatantai gebėjo skatinti M. luteus augimą.
2. Daugumoje tirtų atvejų nenustatyta pastebimo kultūrų poveikio viena kitos augimui –
11 iš 15 – os kultūrų slopino bent vieną kitą kultūrą, tačiau tik 4 iš 11 buvo slopinamos kitų kultūrų.
Išimtį sudarė J4a1.2 ir J4a5, kurios buvo veikiamos daugelio kitų kultūrų tiek slopinančiai, tiek
augimą skatinančiai.
Tik vienos kultūros supernatantas gebėjo inhibuoti vienos iš testinių epifitinių bakterijų augimą.
Pastebėta, kad kelios epifitinės bakterijos geba skatinti kitų epifitinių bakterijų augimą veikiant tiriamos kultūros bakterine suspensija ar steriliu supernatantu. Visų 15 – os tiriamųjų epifitų sekretuojamos medžiagos gebėjo skatinti testinės J4a1. 2 augimą.
3. Dešimt iš penkiolikos tiriamų epifitinių kultūrų gebėjo išskirti fermentą chitinazę.
Vandenilio cianidą išskyrė dvi kultūros – M2a2 ir Vp2a1. Jokio epifitinių bakterijų sekretuojamų
medžiagų poveikio slopinant mielių augimą nenustatyta.
5. Atlikus epifitinių bakterijų molekulinius tyrimus nustatyta, kad tirtos kultūros priklauso dviem skirtingom bakterijų grupėm. Didžioji dalis priklauso gamaproteobakterijom, Pseudomonas genčiai. J4a3 ir J4a4 priklauso aktinobakterijoms (Actinomycetales).
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ahmad F, Ahmad I, Khan MS. Screening of free – living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research. 2008; 163: 173 – 81.
2. Alamri SA. Epiphytic Microflora on the Leaves of Juniperus procera from Aseer Region, Saudi Arabia. Journal of Biological Sciences. 2008; 8 (5): 857 – 865.
3. Alberghini S, Battisti A, Squartini A. Methods and detection limits in tracking a genetically modified Pseudomonas sp. released in the pine phylosphere. Ann Microbiol. 2008; 58 (1): 167 – 7.
4. Beattie GA. Plant – associated bacteria: survey, molecular phylogeny, genomics and recent advances. In: Gnanamanickam SS, editor. Plant – Associated Bacteria. Netherlands: Springer; 2006 . p. 1 – 56.
5. Biology.clc.uc.edu [internetinė svetainė]. Agar Overlay Technique. Sukurta 2001
[atnaujinta 2010 08 04; cituota 2013 05 1].
Adresas: http://biology.clc.uc.edu/frankhauser/Labs/Microbiology/Bacterial Inhibit ion/Agar Overlay.htm.
6. DE Brito Alvarez MA, Gagne S, Antoun H. Effect of Compost on Rhizosphere Microflora of the Tomato and on the Incidence of Plant Growth – Promoting Rhizobacteria. Appl Environ Microbiol. 1995; 61 (1): 194 – 9.
7. Crocker FH, Fredrickson JK, White C, Ringelberg DB, Balkwill DL. Phylogenetic and physiological diversity of Arthrobacter strains isolated from unconsolidated subsurface sediments. Microbiology. 2000; 146: 1295 – 1310.
8. Desnous N, Lin M, Guo X, Ma L, Carreno – Lopez R, Elmerich C. Nitrogen fixation genetics and regulation in a Pseudomonas stutzeri strain associated with rice. Microbiology. 2003; 149: 2251 – 2262.
9. Delmotte N, Knief C, Chaffron S, Innerebner G, Roschitzki B, Schlapbach R, von Mering C, Vorholt JA. Community proteogenomics reveals insights into the physiology of phyllosphere bacteria. PNAS. 2009; 106: 16428 – 33.
10. Dilatha Fernando WG, Ramarathnam R, Krishnamoorthy AS, Savchuk SC. Identification and use of potential bacterial organic antifungal volatiles in biocontrol. Soil Biology and Biochemistry. 2005; 37: 955 – 64.
11. Gnanamanickam SS, Ebenezar Immanuel J. Epiphytic bacteria, their ecology and functions. In: Gnanamanickam SS, editor. Plant – Associated Bacteria. Netherlands: Springer; 2006 . p . 131 – 153.
12. Hardoim PR, Overbeek LS, Elsas ID. Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth. Trends Microbiol. 2008; 16 (10): 463 – 71.
13. Hashidoko Y. Ecochemical Studies of Interrelationships between Epiphytic Bacteria and Host Plants via Secondary Metabolites. Bioschi Biotechnol Biochem. 2005; 69 (8): 1427 – 1441.
14. Hsu SC, Lockwood JL. Powdered Chitin Agar as a Selective Medium for Enumeration of Actinomycetes in Water and Soil. Appl Microbiol. 1975; 29 (3):
422 – 6.
15. Yan Y, Yang J, Dou Y, Chen M, Ping S, Peng J, Lu W, Zhang W, Yao Z, Li H, Liu
W, He S, Geng L, Zhang X, Yang F, Yu H, Zhan Y, Li D, Lin Z, Wang Y,
Elmerich C, Lin M, Jin Q. Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri. PNAS. 2008; 105 (21): 7564 – 9.
16. Jeon JS, Lee SS, Kim HY, Ahn TS, Song HG. Plant Growth Promotion in Soil by
Some Inoculated Microorganisms. J Microbiol. 2003; 41 (4): 271 – 6.
17. Kamil Z, Rizk M, Saleh M, Moustafa S. Isolation and Identification of Rhizosphere
Soil Chitinolytic Bacteria and their Potential in Antifungal Biocontrol. Global
Journal of Molecular Sciences. 2007; 2 (2): 57-66.
18. Kampfer P, Anderson MA, Raine FA, Kroppenstedt RM, Salkinoja-Salonen M.
Williamsia muralis gen. nov., sp. nov., isolated from the indoor environment of a
children’s day care centre. International Journal of Systematic Bacteriology. 1999;
49: 681 – 7.
19. Lenney W, Gilchrist FJ. Pseudomonas aeruginosa and cyanide production. Eur Respir J. 2011; 37: 482 – 3.
20. Lindow SE, Brandl MT. Microbiology of the Phyllosphere. Appl Environ Microbiol. 2003; 69 (4): 1875 – 1883.
21. Muzzamal H, Sarwar R, Sajid I, Hasnai S. Isolation, Identification and Screening of Endophytic Bacteria Antagonistic to Biofil Formers. Pakistan J Zool. 2012; 44 (1):
249 -257.
22. (O Sullivan DJ, (T Gara F. Traits of fluorescents Pseudomonas spp. involved in
suppression of plant root pathogens. Microbiol Rev. 1992; 56 (4): 662 – 76.
23. Ping L, Boland W. Signals from the underground: bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis. Trends in Plant Science. 2004; 9 (6).
24. Reinhold – Hurek B, Hurek T. Living inside plants: bacterial endophytes. Plant Biology. 2011; 14: 435 – 443.
25. Ribeiro CM, Cardoso EJBN. Isolation, selection and characterization of root -associated growth promoting bacteria in Brazil Pine (Araucaria angustifolia).
Microbiological Research 2012; 167: 69-78.
26. Rust LA, Fry WE, and Beer SV. Hydrogen Cyanide Sensitivity in Bacterial Pathogens of Cyanogenic and Non-Cyanogenic Plants. Phytopathology. 1980; 70: 1005 – 8.
27. Scheublin TR, Leveau JHJ. Isolation of Arthrobacter species from the phyllosphere and demonstration of their epiphytic fitness. MicrobiologyOpen. 2013; 2 (1): 205 –
13.
28. Shishido M, Massicotte HB, Chanway CP. Effect of Plant Growth Promoting Bacillus strains on Pine and Spruce Seedling Growth an Mycorrhizal Infection. Annals of Botany. 1996; 77: 433 – 441.
29. Shishido M, Chanway CP. Spruce growth response specifity after treatment with plant growth – promoting Pseudomonads. Can J Bot. 1999; 77: 22-31.
30. Usharami TR, Gowda TKS. Cloning of chitinase gene from Bacillus thuringiensis. Indian Journal of Biotechnology. 2011; 10: 264 – 9.
31. Vaštakaitė V. Augalų augimą skatinančių savybių nustatymas pušų spyglių paviršiaus bakterijose [bakalauro darbas]. Kaunas: Vytauto Didžiojo universitetas;
2011.
32. Vaštakaitė V, Buzaitė O. Plant growth promoting properties of culturable phylloepiphytic pine bacteria. Biologija. 2011; 57(1): 33 – 6.
33. Vega K, Kalkum M. Chitin, Chitinase Responses, and Invasive Fungal Infections. International Journal of Microbiology [tęstinis leidinys]. 2012 [cituota 2013 05 01]. Adresas: http://www.hindawi.com/journals/ijmb/2012/920459/.
34. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. J Bacteriol. 1991; 173 (2): 697 – 703.

Darbo autorius: V. Vaštakaitė
Atsisiųsti pilną darbą fitoplano-bakterijos